骨骼肌纖維是骨骼肌的主要組成部分,而肌纖維的數(shù)目由出生前肌源細胞的成肌分化進程所決定,直接影響家畜的生長潛能和肉質。MyoD依賴的肌肉特異性基因的染色質重塑激活是控制成肌分化的重要方式,受PI3K/Akt和p38信號通路共同調控;SKIP（Skeletal muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase）在成肌分化過程中上調表達,并負調控成肌分化。本課題旨在探究C2C12成肌分化過程中SKIP與PI3K/Akt和p38信號通路之間的關系。主要研究結果如下:1)2%馬血清誘導C2C12成肌分化,通過熒光定量PCR以及蛋白質免疫印跡檢測SKIP的表達、亞硫酸氫鹽方法檢測成肌分化前后SKIP調控區(qū)DNA甲基化狀態(tài)、ATAC-seq技術檢測成肌分化前后SKIP的染色質開放狀態(tài)、ChIP檢測成肌分化前后轉錄因子MyoD以及甲基化組蛋白H3K27me3與SKIP啟動子的結合情況。結果表明:SKIP的mRNA水平以及蛋白水平均在成肌分化中上調表達;相比成肌分化前,成肌分化后SKIP調控區(qū)DNA甲基化的分布發(fā)生改變,程度無明顯差異;在成肌分化前,SKIP... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 前言
    2 SKIP研究進展
        2.1 SKIP在胰島素信號中的研究
        2.2 SKIP在成肌分化中的研究
        2.3 SKIP在肌纖維發(fā)育中的研究
    3 PI3K/Akt信號通路
    4 p38絲裂原活化蛋白激酶通路
    5 MyoD與 PI3K/Akt和 p38 信號通路
    6 研究目的與意義
第二章 材料和方法
    1 試驗材料
        1.1 載體和細胞系
        1.2 主要儀器和設備
        1.3 主要試劑
        1.4 主要溶液的配制
            1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測所需溶液配制
            1.4.2 細胞培養(yǎng)所需溶液的配制
            1.4.3 抑制劑工作液的配制
            1.4.4 Western blot試劑
    2 試驗方法
        2.1 PCR產物的檢測與鑒定
            2.1.1 連接克隆載體
            2.1.2 DH5α感受態(tài)大腸桿菌快速轉化
            2.1.3 擴大培養(yǎng)和菌液PCR檢測
        2.2 腺病毒感染細胞
        2.3 細胞培養(yǎng)
            2.3.1 細胞復蘇
            2.3.2 細胞培養(yǎng)和傳代
            2.3.3 細胞凍存
        2.4 細胞免疫熒光(6孔板)
        2.5 熒光定量PCR分析
            2.5.1 總RNA的提取
            2.5.2 RNA濃度測定和質量檢測
            2.5.3 反轉錄c DNA的合成
            2.5.4 cDNA質量檢測
            2.5.5 實時定量PCR引物設計
            2.5.6 實時熒光定量法對基因的驗證
        2.6 Western Blot試驗方法
            2.6.1 細胞總蛋白的提取
            2.6.2 蛋白濃度測定
            2.6.3 蛋白變性
            2.6.4 Western Blot具體步驟
        2.7 ChIP
        2.8 甲基化分析模板的處理
        2.9 生物學工具
        2.10 統(tǒng)計學分析
第三章 結果與分析
    第一部分 成肌分化對SKIP表達的影響
        1 成肌分化過程中SKIP的表達改變
        2 成肌細胞分化前后SKIP調控區(qū)DNA甲基化狀態(tài)
        3 成肌分化前后SKIP的染色質開放狀態(tài)
        4 成肌細胞分化前后轉錄因子MyoD及甲基化的組蛋白(H3K27me3)與SKIP啟動子的結合情況
    第二部分 PI3K和 p38 信號通路對成肌分化過程中SKIP表達調控的影響
        1 p-AKT、p-p38 信號對成肌分化的影響
        2 p-AKT、p-p38 信號對SKIP表達的影響
        3 p-AKT信號通過介導MyoD與 SKIP啟動子的結合影響SKIP的表達
    第三部分 超表達山羊SKIP基因對成肌分化的影響
        1 腺病毒合適MOI的確定以及SKIP超表達效果的檢測
        2 成肌分化不同階段SKIP超表達效果分析
        3 超表達SKIP對成肌分化標志基因表達的影響
        4 超表達SKIP對成肌分化關鍵信號蛋白p-AKT、p-p38 表達的影響
第四章 討論
    1 SKIP與 MyoD結合介導染色質重塑
    2 成肌分化過程中SKIP與 PI3K/Akt和 p38 信號通路之間的相互關系
    3 C2C12成肌分化過程中SKIP反饋調節(jié)PI3K/Akt、p38信號通路
第五章 小結
    1 主要結論
    2 本研究創(chuàng)新之處
    3 本研究的不足之處
    4 下一步工作計劃
參考文獻
研究生在讀期間發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3199204