骨骼肌纖維是骨骼肌的主要組成部分,而肌纖維的數(shù)目由出生前肌源細(xì)胞的成肌分化進(jìn)程所決定,直接影響家畜的生長潛能和肉質(zhì)。MyoD依賴的肌肉特異性基因的染色質(zhì)重塑激活是控制成肌分化的重要方式,受PI3K/Akt和p38信號通路共同調(diào)控;SKIP（Skeletal muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase）在成肌分化過程中上調(diào)表達(dá),并負(fù)調(diào)控成肌分化。本課題旨在探究C2C12成肌分化過程中SKIP與PI3K/Akt和p38信號通路之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1)2%馬血清誘導(dǎo)C2C12成肌分化,通過熒光定量PCR以及蛋白質(zhì)免疫印跡檢測SKIP的表達(dá)、亞硫酸氫鹽方法檢測成肌分化前后SKIP調(diào)控區(qū)DNA甲基化狀態(tài)、ATAC-seq技術(shù)檢測成肌分化前后SKIP的染色質(zhì)開放狀態(tài)、ChIP檢測成肌分化前后轉(zhuǎn)錄因子MyoD以及甲基化組蛋白H3K27me3與SKIP啟動子的結(jié)合情況。結(jié)果表明:SKIP的mRNA水平以及蛋白水平均在成肌分化中上調(diào)表達(dá);相比成肌分化前,成肌分化后SKIP調(diào)控區(qū)DNA甲基化的分布發(fā)生改變,程度無明顯差異;在成肌分化前,SKIP... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 前言
    2 SKIP研究進(jìn)展
        2.1 SKIP在胰島素信號中的研究
        2.2 SKIP在成肌分化中的研究
        2.3 SKIP在肌纖維發(fā)育中的研究
    3 PI3K/Akt信號通路
    4 p38絲裂原活化蛋白激酶通路
    5 MyoD與 PI3K/Akt和 p38 信號通路
    6 研究目的與意義
第二章 材料和方法
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 載體和細(xì)胞系
        1.2 主要儀器和設(shè)備
        1.3 主要試劑
        1.4 主要溶液的配制
            1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測所需溶液配制
            1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)所需溶液的配制
            1.4.3 抑制劑工作液的配制
            1.4.4 Western blot試劑
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 PCR產(chǎn)物的檢測與鑒定
            2.1.1 連接克隆載體
            2.1.2 DH5α感受態(tài)大腸桿菌快速轉(zhuǎn)化
            2.1.3 擴(kuò)大培養(yǎng)和菌液PCR檢測
        2.2 腺病毒感染細(xì)胞
        2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代
            2.3.3 細(xì)胞凍存
        2.4 細(xì)胞免疫熒光(6孔板)
        2.5 熒光定量PCR分析
            2.5.1 總RNA的提取
            2.5.2 RNA濃度測定和質(zhì)量檢測
            2.5.3 反轉(zhuǎn)錄c DNA的合成
            2.5.4 cDNA質(zhì)量檢測
            2.5.5 實(shí)時定量PCR引物設(shè)計(jì)
            2.5.6 實(shí)時熒光定量法對基因的驗(yàn)證
        2.6 Western Blot試驗(yàn)方法
            2.6.1 細(xì)胞總蛋白的提取
            2.6.2 蛋白濃度測定
            2.6.3 蛋白變性
            2.6.4 Western Blot具體步驟
        2.7 ChIP
        2.8 甲基化分析模板的處理
        2.9 生物學(xué)工具
        2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第三章 結(jié)果與分析
    第一部分 成肌分化對SKIP表達(dá)的影響
        1 成肌分化過程中SKIP的表達(dá)改變
        2 成肌細(xì)胞分化前后SKIP調(diào)控區(qū)DNA甲基化狀態(tài)
        3 成肌分化前后SKIP的染色質(zhì)開放狀態(tài)
        4 成肌細(xì)胞分化前后轉(zhuǎn)錄因子MyoD及甲基化的組蛋白(H3K27me3)與SKIP啟動子的結(jié)合情況
    第二部分 PI3K和 p38 信號通路對成肌分化過程中SKIP表達(dá)調(diào)控的影響
        1 p-AKT、p-p38 信號對成肌分化的影響
        2 p-AKT、p-p38 信號對SKIP表達(dá)的影響
        3 p-AKT信號通過介導(dǎo)MyoD與 SKIP啟動子的結(jié)合影響SKIP的表達(dá)
    第三部分 超表達(dá)山羊SKIP基因?qū)Τ杉》只挠绊?br>        1 腺病毒合適MOI的確定以及SKIP超表達(dá)效果的檢測
        2 成肌分化不同階段SKIP超表達(dá)效果分析
        3 超表達(dá)SKIP對成肌分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響
        4 超表達(dá)SKIP對成肌分化關(guān)鍵信號蛋白p-AKT、p-p38 表達(dá)的影響
第四章 討論
    1 SKIP與 MyoD結(jié)合介導(dǎo)染色質(zhì)重塑
    2 成肌分化過程中SKIP與 PI3K/Akt和 p38 信號通路之間的相互關(guān)系
    3 C2C12成肌分化過程中SKIP反饋調(diào)節(jié)PI3K/Akt、p38信號通路
第五章 小結(jié)
    1 主要結(jié)論
    2 本研究創(chuàng)新之處
    3 本研究的不足之處
    4 下一步工作計(jì)劃
參考文獻(xiàn)
研究生在讀期間發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3199204