豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的豬的一種高度接觸性傳染病。在過去的幾十年中，我國通過采取兔化弱毒疫苗免疫接種與撲殺相結(jié)合等措施，有效地控制了豬瘟的流行，但近年來我國豬瘟疫情又有所抬頭，尤其是慢性豬瘟和非典型豬瘟成為該病的主要發(fā)生形式，給豬瘟防控工作造成了新的困難。雖然近年來對CSFV致病機理的研究取得一定進展，但之前的研究工作中，主要是對全病毒或病毒的某個或某些基因?qū)λ拗骷毎囊恍┲虏∽饔眉捌錂C理進行研究，而缺乏對CSFV感染后宿主細胞轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控應(yīng)答的系統(tǒng)分析，不清楚哪些應(yīng)答才是CSFV強毒株引起宿主細胞發(fā)生的致病性及病理性改變的關(guān)鍵所在。為此，本論文開展豬瘟病毒石門株與豬瘟病毒C株感染豬靜脈血管內(nèi)皮細胞（SUVEC）及巨噬細胞后宿主細胞基因表達的差異性研究，并通過對豬瘟病毒感染后宿主細胞mRNA轉(zhuǎn)錄組水平的基因調(diào)控應(yīng)答特征分析，為闡明豬瘟病毒的致病機理提供有價值的科學依據(jù)。研究工作取得了以下結(jié)果：（1）建立了區(qū)分豬瘟病毒石門株與豬瘟病毒C株的高分辨率熔解曲線（HRM）檢測方法。與以往PCR技術(shù)比較，該方法具有單管操作、無須設(shè)計特異性探針等優(yōu)勢，既可以實現(xiàn)對豬瘟病毒石門株... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻綜述
    第一章 病毒與宿主細胞的相互作用及豬瘟病毒研究進展
        1.1 病毒與宿主細胞的相互作用
            1.1.1 病毒感染細胞的基本生命特征
            1.1.2 病毒感染細胞后相互作用的差異性
            1.1.3 細胞對病毒感染的應(yīng)答
        1.2 豬瘟病毒研究進展
            1.2.1 豬瘟病毒感染的分子生物學基礎(chǔ)
            1.2.2 豬瘟病毒感染的復(fù)雜機制
        1.3 應(yīng)用高通量測序技術(shù)開展豬瘟病毒致病機制研究的可行性
試驗研究
    第二章 高分辨率溶解曲線技術(shù)區(qū)分豬瘟病毒石門株和 C 株檢測方法的建立
        2.1 材料
            2.1.1 病毒株、細胞系及臨床樣品
            2.1.2 主要試劑及耗材
            2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.2 方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)及病毒的感染
            2.2.2 臨床樣品的準備
            2.2.3 RNA 提取與純化
            2.2.4 cDNA 的合成
            2.2.5 引物的設(shè)計與合成
            2.2.6 CSFV 的 PCR 檢測
            2.2.7 通過 HRM 分析法檢測和鑒別 CSFV Shimen 株和 C 株
            2.2.8 質(zhì)量控制
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 SUVEC 中 CSFV 的 PCR 檢測
            2.3.2 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 qPCR 檢測
            2.3.3 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 HRM 標準化檢測
            2.3.4 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 HRM 鑒別性檢測
            2.3.5 臨床樣品中 CSFV 的 PCR 檢測
            2.3.6 應(yīng)用 HRM 分析方法檢測臨床樣品的 CSFV 感染
            2.3.7 應(yīng)用 HRM 分析方法鑒別感染臨床樣本的 CSFV 不同毒力株
            2.3.8 質(zhì)量控制
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 高通量測序技術(shù)解讀豬瘟病毒石門株感染 SUVEC 后的基因早期表達
        3.1 材料
            3.1.1 病毒株、細胞系
            3.1.2 主要試劑及耗材
            3.1.3 主要儀器設(shè)備
            3.1.4 配制的溶液
        3.2 方法
            3.2.1 細胞培養(yǎng)、病毒感染及 RNA 提取
            3.2.2 cDNA 的合成
            3.2.3 CSFV 檢測引物的設(shè)計與合成
            3.2.4 CSFV 的 PCR 檢測
            3.2.5 SUVEC 的 DGE 標簽文庫的構(gòu)建和 Solexa 測序
            3.2.6 DGE 標簽文庫的標簽篩選
            3.2.7 基因表達注釋
            3.2.8 篩選差異表達基因
            3.2.9 Gene Ontology 功能顯著性與 Pathway 顯著性富集分析
            3.2.10 DGE 檢測的 qPCR 驗證
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 DGE 測序標簽文庫的分析結(jié)果
            3.3.2 基因注釋與結(jié)果分析
            3.3.3 DGE 測序文庫的生物重復(fù)性檢測
            3.3.4 DEG 分析差異表達基因的確定
            3.3.5 差異表達基因的鑒別注釋
            3.3.6 差異表達基因的 GO 功能富集性分析
            3.3.7 差異表達基因的信號通路富集性分析
            3.3.8 qPCR 方法對 DGE 檢測分析結(jié)果的驗證
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 豬瘟病毒石門株和 C 株感染 SUVEC 差異表達基因分析
        4.1 材料
            4.1.1 病毒株與細胞系
            4.1.2 主要試劑及耗材
            4.1.3 主要儀器設(shè)備
        4.2 方法
            4.2.1 細胞培養(yǎng)、病毒感染及 RNA 提取
            4.2.2 CSFV 檢測引物的設(shè)計與合成
            4.2.3 cDNA 的合成
            4.2.4 CSFV 的 PCR 檢測
            4.2.5 qPCR 法建立 CSFV 增殖曲線
            4.2.6 DGE 標簽文庫的構(gòu)建和 Solexa 測序
            4.2.7 DGE 標簽文庫的標簽篩選及基因表達注釋
            4.2.8 差異表達基因的篩選
            4.2.9 Gene Ontology 功能顯著性與 Pathway 顯著性富集分析
            4.2.10 DGE 檢測分析結(jié)果的驗證
            4.2.11 DGE 的聚類分析和網(wǎng)絡(luò)互作分析
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 SUVEC 的 RNA 質(zhì)量檢測
            4.3.2 CSFV 的 RT-PCR 檢測和 qPCR 檢測結(jié)果
            4.3.3 DGE 測序標簽文庫的分析結(jié)果
            4.3.4 DGE 測序標簽文庫的測序飽和度分析
            4.3.5 差異表達基因的確定
            4.3.6 差異表達基因的 GO 功能富集分析
                4.3.6.1 CSFV Shimen 感染組和未感染病毒組差異基因的 GO 功能富集性分析
                4.3.6.2 CSFV C 感染組和未感染病毒組差異基因的 GO 功能富集性分析
                4.3.6.3 CSFV Shimen 感染組和 CSFV C 感染組差異基因的 GO 功能富集性分析
            4.3.7 差異表達基因的 Pathway 富集分析
            4.3.8 CSFV Shimen 株與 CSFV C 株不同感染對血液循環(huán)系統(tǒng)關(guān)鍵基因表達的影響
            4.3.9 血液循環(huán)系統(tǒng)差異表達關(guān)鍵基因的 GO 功能歸類分析
            4.3.10 DGE 檢測分析結(jié)果的 qPCR 驗證
        4.4 討論
            4.4.1 CSFV Shimen 株感染對 SUVEC 應(yīng)答機制的分析
            4.4.2 感染與血液循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)基因表達的關(guān)系
        4.5 小結(jié)
    第五章 豬瘟病毒石門株對 SUVEC 中 VEGF-C 表達的影響
        5.1 材料
            5.1.1 病毒株與細胞系
            5.1.2 主要試劑
            5.1.3 主要儀器設(shè)備
        5.2 方法
            5.2.1 CSFV Shimen 株感染 SUVEC
            5.2.2 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 RT-PCR 檢測
            5.2.3 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 qPCR 檢測
            5.2.4 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的間接免疫熒光法檢測
            5.2.5 VEGF 表達的生物信息學分析
            5.2.6 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF 表達的 ELISA 檢測
            5.2.7 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表達的 PCR 檢測
            5.2.8 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表達的 qPCR 檢測
            5.2.9 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表達的 Western blot 檢測
            5.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 VEGF 表達的生物信息學分析
            5.3.2 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 RT-PCR 檢測
            5.3.3 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 Realtime-PCR 檢測
            5.3.4 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的間接免疫熒光法檢測
            5.3.5 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF 表達的 ELISA 檢測
            5.3.6 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表達的 PCR 檢測
            5.3.7 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表達的 qPCR 檢測
            5.3.8 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表達的 Western blot 檢測
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
    第六章 豬瘟病毒石門株和 C 株感染巨噬細胞差異表達基因分析及石門株對 P53 信號通路調(diào)控的初步研究
        6.1 材料
            6.1.1 病毒株與細胞系
            6.1.2 主要試劑及耗材
            6.1.3 主要儀器設(shè)備
        6.2 方法
            6.2.1 細胞培養(yǎng)、病毒感染及 RNA 提取
            6.2.2 CSFV 檢測引物的設(shè)計與合成
            6.2.3 cDNA 的合成
            6.2.4 CSFV 感染巨噬細胞后的 PCR 檢測和 qPCR 檢測
            6.2.5 DGE 標簽文庫的構(gòu)建、Solexa 測序、標簽篩選及注釋表達基因
            6.2.6 差異表達基因的篩選及 qPCR 驗證
            6.2.7 Gene Ontology 功能顯著性與 Pathway 顯著性富集分析
            6.2.8 流式細胞儀檢測細胞周期
            6.2.9 細胞因子 mRNA 的 qPCR 檢測和表達蛋白的 Western blot 檢測
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 巨噬細胞的 RNA 質(zhì)量檢測
            6.3.2 巨噬細胞中 CSFV 的 RT-PCR 檢測和 qPCR 檢測結(jié)果
            6.3.3 DGE 測序標簽文庫的分析結(jié)果
            6.3.4 DGE 測序標簽文庫的測序飽和度分析
            6.3.5 差異表達基因的確定
            6.3.6 差異表達基因的 GO 功能富集分析
            6.3.7 差異表達基因的 Pathway 富集顯著性分析
            6.3.8 DGE 檢測分析結(jié)果的 qPCR 驗證
            6.3.9 CSFV Shimen 株致巨噬細胞 p53 信號通路調(diào)控細胞周期改變的初步研究
        6.4 討論
        6.5 小結(jié)
結(jié)論
本研究的創(chuàng)新點
參考文獻
主要縮略詞和中英文對照表（Abbreviation Index）
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]非典型豬瘟的發(fā)病特點及控制措施[J]. 陳芹.  福建畜牧獸醫(yī). 2012(03)
[2]自身免疫性肝炎新型抗原分子高遷移率族蛋白B1的克隆表達鑒定及蛋白純化[J]. 趙擎,辛紹杰,胡燕,侯俊,貌盼勇.  實用預(yù)防醫(yī)學. 2007(01)



本文編號：3194165