為探索牛分枝桿菌通過(guò)RIPK1來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,本試驗(yàn)利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-RIPK1,并通過(guò)PEG/LiAc轉(zhuǎn)化法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌中,經(jīng)Western blot驗(yàn)證RIPK1在酵母菌中的表達(dá)情況后,使用該重組酵母菌篩選牛分枝桿菌基因組文庫(kù);篩選所得陽(yáng)性克隆經(jīng)互補(bǔ)驗(yàn)證、測(cè)序分析以及免疫共沉淀法,最終確定可與RIPK1互相作用的牛分枝桿菌蛋白。結(jié)果表明,成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-RIPK1,該誘餌質(zhì)粒可在酵母菌中表達(dá)RIPK1蛋白;用該酵母菌篩選牛分枝桿菌基因組文庫(kù)共獲得16個(gè)陽(yáng)性克隆;這些陽(yáng)性克隆經(jīng)互補(bǔ)驗(yàn)證、測(cè)序和BLAST對(duì)比后共發(fā)現(xiàn)翻譯正確的7個(gè)牛分枝桿菌蛋白;分別構(gòu)建RIPK1和牛分枝桿菌候選蛋白的真核表達(dá)載體,經(jīng)免疫共沉淀驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)可與RIPK1互作的3個(gè)牛分枝桿菌蛋白,分別為Mb0869c、Mb0383c和Mb2314,本研究為進(jìn)一步研究牛分枝桿菌通過(guò)RIPK1調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,40(09)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞株
    1.2 主要試劑
    1.3 人RIPK1基因的擴(kuò)增
    1.4 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-RIPK1的構(gòu)建
    1.5 重組酵母菌的構(gòu)建
    1.6 篩選與RIPK1互作的牛分枝桿菌蛋白
    1.7 陽(yáng)性克隆的互補(bǔ)驗(yàn)證及測(cè)序
    1.8 免疫共沉淀法驗(yàn)證蛋白的互相作用
        1.8.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.8.2 免疫共沉淀法
2 結(jié)果
    2.1 構(gòu)建含有RIPK1基因的誘餌質(zhì)粒
    2.2 誘餌蛋白R(shí)IP1在酵母菌中的表達(dá)情況
    2.3 篩選牛分枝桿菌基因組文庫(kù)
    2.4 回補(bǔ)驗(yàn)證陽(yáng)性克隆
    2.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    2.6 免疫沉淀法驗(yàn)證分枝桿菌候選蛋白與RIPK1互作情況
3 討 論



本文編號(hào)：3191705