A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康的重要病原。IAV感染可通過多種調(diào)節(jié)機(jī)制迅速誘發(fā)宿主先天免疫反應(yīng),這對于病原體的清除和宿主的存活至關(guān)重要。然而,過度的炎癥反應(yīng)即“炎性風(fēng)暴”將導(dǎo)致宿主免疫致病。IAV的M2（matrix protein 2）基質(zhì)蛋白,是一個(gè)在流感病毒致病中很重要的質(zhì)子選擇性離子通道蛋白,它可刺激激活NLRP3（NLR family pyrin domain containing3）炎癥小體的形成。自噬發(fā)生在胞質(zhì),是一個(gè)將壽命較長的蛋白、受損的細(xì)胞器及蛋白聚集體等進(jìn)行包裹后與溶酶體融合發(fā)生降解的過程。其分為自噬小體形成及自噬小體與溶酶體融合兩個(gè)階段。流感病毒M2蛋白不但能夠參與流感病毒感染后自噬小體形成的起始過程,還可抑制自噬小體與溶酶體的融合。但是M2蛋白是如何調(diào)節(jié)自噬的誘導(dǎo)過程及其與天然免疫之間的關(guān)系目前尚不清楚。另外,IAV也可通過多種復(fù)雜的免疫逃避機(jī)制以逃避宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。其中,由IAV聚合酶蛋白PB1（Polymerase basic protein 1）編碼的輔助蛋白PB1-F2可以使線粒體膜電勢坍塌,且與... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：178 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

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摘要
Abstract
縮略語(Abbreviation)
第一章 流感病毒M2 蛋白通過與MAVS相互作用及增加ROS產(chǎn)量調(diào)節(jié)MAVS介導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制的研究
    1.前言
        1.1 細(xì)胞自噬概述
            1.1.1 自噬的定義
            1.1.2 自噬的分類
            1.1.3 自噬的過程及自噬體形成的分子機(jī)制
            1.1.4 自噬信號(hào)通路的調(diào)控
            1.1.5 自噬與病毒感染
            1.1.6 自噬與RLRs及 I型 IFN信號(hào)途徑
        1.2 流感病毒
            1.2.1 流感病毒概述
            1.2.2 流感病毒與自噬
            1.2.3 流感病毒與天然免疫反應(yīng)
        1.3 流感病毒基質(zhì)蛋白M2
            1.3.1 M2 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
            1.3.2 M2 蛋白的合成、裝配、翻譯后修飾及向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)
            1.3.3 M2 蛋白調(diào)節(jié)vRNP的釋放
            1.3.4 M2 蛋白與病毒出芽及釋放
            1.3.5 M2 蛋白與宿主致病性
        1.4 研究目的與意義
    2 實(shí)驗(yàn)材料與試驗(yàn)方法
        2.1 細(xì)胞與病毒
        2.2 試劑和抗體
        2.3 載體與質(zhì)粒
        2.4 siRNA合成
        2.5 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配制
        2.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.7 實(shí)驗(yàn)方法
            2.7.1 基因克隆
            2.7.2 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
            2.7.3 細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
            2.7.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            2.7.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)
            2.7.6 細(xì)胞總RNA抽提
            2.7.7 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)
            2.7.8 細(xì)胞總基因組DNA抽提
            2.7.9 Real-time RT-PCR
            2.7.10 Western blot
            2.7.11 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CoIP)
            2.7.12 SDD-AGE(半變性瓊脂糖膠蛋白電泳)
            2.7.13 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)與SIM
            2.7.14 線粒體-胞質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)
            2.7.15 流式系統(tǒng)分析
            2.7.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    3 結(jié)果與分析
        3.1 M2 蛋白誘導(dǎo)自噬通過激活A(yù)TG5,抑制AKT-MTOR通路
            3.1.1 H5N1/HM病毒M2 蛋白離子通道活性參與其誘導(dǎo)自噬小體的聚集過程
            3.1.2 H5N1/HM病毒M2 蛋白能誘導(dǎo)自噬小體的起始且抑制自噬溶酶體形成
            3.1.3 H5N1/HM M2 蛋白誘導(dǎo)自噬的起始依賴于ATG5及AKT-MTOR途徑
        3.2 M2 蛋白觸發(fā)的Ca2+與ROS的產(chǎn)生參與了M2 誘導(dǎo)的自噬過程
            3.2.1 M2 蛋白觸發(fā)了Ca2+與ROS產(chǎn)量的升高
            3.2.2 M2 蛋白誘導(dǎo)的Ca2+與ROS產(chǎn)量參與了其誘導(dǎo)的自噬過程
        3.3 M2 蛋白能夠定位于線粒體且影響線粒體動(dòng)態(tài)
            3.3.1 M2 蛋白能夠靶向于線粒體
            3.3.2 M2 蛋白促進(jìn)了線粒體融合、增加了線粒體數(shù)量
        3.4 M2 蛋白增強(qiáng)了天然免疫反應(yīng)
            3.4.1 M2 蛋白增強(qiáng)了SEV刺激激活的天然免疫反應(yīng)
            3.4.2 M2 蛋白增強(qiáng)了SEV刺激下IRF3與NFKB的磷酸化及Pro-IL1B表達(dá)
            3.4.3 M2 蛋白參與了胞內(nèi)抗病毒反應(yīng)
            3.4.4 M2 蛋白增強(qiáng)的天然免疫反應(yīng)依賴于其離子通道活性
        3.5 RLR通路中M2 蛋白靶分子的檢測
            3.5.1 M2 蛋白增強(qiáng)了MAVS介導(dǎo)的抗病毒天然免疫反應(yīng)
            3.5.2 M2與MAVS相互作用并共定位
            3.5.3 M2 蛋白與ATG5及LC3B競爭性的與MAVS結(jié)合
            3.5.4 M2 蛋白增加了MAVS聚集體的形成
        3.6 M2 蛋白與MAVS互作區(qū)域的探究
            3.6.1 M2 蛋白上His37 是其與MAVS相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)
            3.6.2 MAVS蛋白的完整性是其與M2 蛋白相互作用所必需的
        3.7 M2 蛋白增加MAVS的聚集依賴于其觸發(fā)的ROS產(chǎn)生
            3.7.1 Ca2+與ROS參與了M2 蛋白增強(qiáng)的抗病毒天然免疫反應(yīng)
            3.7.2 M2 蛋白增加MAVS聚集體的形成依賴于其觸發(fā)的ROS產(chǎn)生
        3.8 M2 蛋白誘導(dǎo)的自噬過程負(fù)向調(diào)節(jié)其增強(qiáng)的天然免疫反應(yīng)
    4 討論與總結(jié)
        4.1 討論
            4.1.1 M2 蛋白誘導(dǎo)了ATG5及AKT-MTOR依賴的自噬過程
            4.1.2 M2 蛋白增強(qiáng)的MAVS介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)與線粒體動(dòng)態(tài)關(guān)系
            4.1.3 M2 蛋白觸發(fā)的ROS的產(chǎn)生與流感病毒致病性關(guān)系
            4.1.4 M2 蛋白拮抗自噬增強(qiáng)天然免疫反應(yīng)
        4.2 總結(jié)
第二章 流感病毒PB1-F2蛋白通過誘導(dǎo)線粒體自噬抑制宿主抗病毒天然免疫的分子機(jī)制研究
    1.前言
        1.1 線粒體自噬
            1.1.1 線粒體自噬及其分子機(jī)制
            1.1.2 線粒體自噬與病毒感染
        1.2 流感病毒蛋白PB1-F2
            1.2.1 PB1-F2 的結(jié)構(gòu)
            1.2.2 PB1-F2 的致病機(jī)理
        1.3 研究目的與意義
    2 實(shí)驗(yàn)材料與試驗(yàn)方法
        2.1 病毒
        2.2 抗體
        2.3 表達(dá)質(zhì)粒及突變體質(zhì)粒構(gòu)建
        2.4 siRNA合成
    3 結(jié)果與分析
        3.1 PB1-F2 蛋白過表達(dá)誘導(dǎo)線粒體自噬
            3.1.1 PB1-F2 蛋白過表達(dá)誘導(dǎo)完全自噬
            3.1.2 PB1-F2 蛋白過表達(dá)誘導(dǎo)線粒體自噬
        3.2 PB1-F2 蛋白介導(dǎo)了TUFM依賴的線粒體自噬
            3.2.1 PB1-F2 蛋白與TUFM蛋白相互作用并共定位
            3.2.2 PB1-F2 蛋白的C端與TUFM蛋白的domain I區(qū)域是兩者相互作用的關(guān)鍵區(qū)域.
        3.3 PB1-F2 蛋白抑制了線粒體自噬依賴的I型 IFN的產(chǎn)生
            3.3.1 PB1-F2 蛋白抑制I型 IFN產(chǎn)生依賴于TUFM
            3.3.2 PB1-F2 蛋白抑制了線粒體自噬依賴的天然免疫反應(yīng)
        3.4 PB1-F2 蛋白作為線粒體自噬受體與LC3B相互作用
            3.4.1 PB1-F2 蛋白與LC3B相互作用
            3.4.2 PB1-F2 蛋白與LC3B相互作用的關(guān)鍵區(qū)域
            3.4.3 PB1-F2 蛋白的LIR區(qū)域是其誘導(dǎo)線粒體自噬的關(guān)鍵區(qū)域
            3.4.4 PB1-F2 蛋白的LIR區(qū)域是其抑制天然免疫的關(guān)鍵區(qū)域
    4 討論與總結(jié)
        4.1 討論
            4.1.1 PB1-F2 蛋白誘導(dǎo)TUFM依賴的完全線粒體自噬
            4.1.2 PB1-F2 蛋白削弱線粒體自噬依賴的I型 IFN的產(chǎn)生
        4.2 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附表1:本文中基因克隆所用的 PCR 引物序列
附表2:本文所用熒光定量 RCR 引物序列
附圖:表達(dá)質(zhì)粒載體圖譜
個(gè)人資料
致謝



本文編號(hào)：3190732