目的：中國(guó)美利奴綿羊是我國(guó)新疆特有的兼肉用與毛用于一體的綿羊品種之一，它的屠宰與使用量也是非常大。然而，對(duì)美利奴綿羊安全和可重復(fù)的生產(chǎn)胚胎的技術(shù)研究不是很多，因此如何提高美利奴綿羊的胚胎生產(chǎn)率便是當(dāng)下待解決的問(wèn)題之一。目前多使用蛋白激酶抑制劑或離子霉素來(lái)人工激活卵母細(xì)胞，其缺點(diǎn)是不清楚它特異性的激活或抑制了某種酶的生物活性，或某種特定蛋白質(zhì)的合成。這種方式對(duì)我們研究激活卵母細(xì)胞卵裂的機(jī)理，或是對(duì)卵母細(xì)胞激活后的發(fā)育因素都是我們無(wú)法不確定的。因此，需要一種全新的激活卵母細(xì)胞的生物制劑，它既不使用蛋白的合成抑制劑又不使用蛋白磷酸化抑制劑，僅通過(guò)單一增加胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度這一決定性因素來(lái)激活卵母細(xì)胞。它的獲得不僅能闡明美利奴綿羊卵母細(xì)胞激活的機(jī)制也能為將來(lái)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的囊胚提供幫助。本實(shí)驗(yàn)為國(guó)內(nèi)首次在綿羊上探究磷脂酶C zeta （PLCζ）真核表達(dá)載體是否可以作為一種新的卵母細(xì)胞激活物質(zhì)。方法：（1）將擴(kuò)增后的基因克隆至PMD-19的T載體上，構(gòu)建了PLCζ克隆載體，然后使用EcoRΙ和BamHΙ雙酶切后，將PLCζ基因與原核表達(dá)載體pCzn1以及pEGFP-N1真核表達(dá)載體連接；（2）將構(gòu)建... 

【文章來(lái)源】：石河子大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫(xiě)詞表
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 磷脂酶 C 的研究進(jìn)展
        1.1 磷脂酶 C 發(fā)現(xiàn)
        1.2 磷脂酶 C 的分類
    2 精子因子假說(shuō)
    3 PEGFP-N1 載體
    4 卵母細(xì)胞的激活方法
        4.1 物理激活
        4.2 化學(xué)激活
        4.3 聯(lián)合激活
    5 PLCΖ的特異之處
        5.1 EF 結(jié)構(gòu)域具有較高的 CA2+敏感性
        5.2 PLCΖ的 C2 區(qū)域?qū)?CA2+振蕩有重要作用
        5.3 PLCΖ的 XY 連接結(jié)構(gòu)具有靶向定位作用
        5.4 精子 PLCΖ的缺陷與雄性不育
    6 研究目的及意義
第二章 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
    試驗(yàn)一 美利奴綿羊磷脂酶 C ZETA 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)研究
        摘要
        2.1 材料
            2.1.1 組織樣品
            2.1.2 試劑、質(zhì)粒及細(xì)胞
        2.2 方法
            2.2.1 PLCζ基因的擴(kuò)增
            2.2.2 目的基因的回收
            2.2.3 pEGFP-N1-PLCζ重組質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定
            2.2.5 轉(zhuǎn)染及重組質(zhì)粒的制備
            2.2.6 pEGFP-N1-PLCζ在 293T 細(xì)胞中的表達(dá)及定位
            2.2.7 pEGFP-N1-PLCζ在綿羊胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 綿羊 PLCζ目的基因的擴(kuò)增
            2.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1-PLCζ的鑒定
            2.3.3 轉(zhuǎn)染后報(bào)告基因的檢測(cè)
            2.3.4 293T 細(xì)胞中融合蛋白 PLCζ-EGFP 的定位觀察結(jié)果
            2.3.5 重組表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1-PLCζ轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細(xì)胞
            2.3.6 陽(yáng)性細(xì)胞的鑒定
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    試驗(yàn)二 美利奴綿羊 PLCΖ基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
        摘要
        3.1 材料
            3.1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑
            3.1.2 主要儀器設(shè)備
        3.2 方法
            3.2.1 PLCζ基因的擴(kuò)增
            3.2.2 目的基因的回收
            3.2.3 pCzn1-PLCζ重組質(zhì)粒構(gòu)建
            3.2.4 pET-28a-PLCζ重組質(zhì)粒構(gòu)建
            3.2.5 菌液 PCR 鑒定目的基因重組質(zhì)粒
            3.2.6 PLCζ重組質(zhì)粒的酶切鑒定
            3.2.7 目的基因的原核表達(dá)
            3.2.8 目的蛋白的純化
            3.2.9 Western-Blot 分析
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 目的基因的擴(kuò)增
            3.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            3.3.3 原核產(chǎn)物的表達(dá)
            3.3.4 融合蛋白的純化和 WB 分析
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    試驗(yàn)三 美利奴綿羊 PLCΖ重組質(zhì)粒對(duì)卵母細(xì)胞激活的初步研究
        摘要
        4.1 材料
            4.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞
            4.1.2 主要試劑
            4.1.3 主要試劑配制
        4.2 方法
            4.2.1 重組質(zhì)粒的制備
            4.2.2 顯微注射針及持卵針的制作
            4.2.3 PBS 緩沖液（Phosphate Buffered Saline）和細(xì)胞培養(yǎng)液 DMEM 的制備
            4.2.4 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備
            4.2.5 卵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的注射
            4.2.6 綿羊卵母細(xì)胞的孤雌激活及體外培養(yǎng)
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)
            4.3.2 卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)粒的顯微注射
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
全文總結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]綿羊精子提取物對(duì)卵母細(xì)胞的孤雌激活作用[J]. 賽務(wù)加甫,張立,彭新榮,郭志林,楊麗,李向臣,何寬軍,安志興,張涌.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2006(07)
[3]蛋白質(zhì)合成抑制劑亞胺環(huán)己酮（CHX）對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J]. 李光鵬,孟慶剛,魏鵬,于元松,常仲樂(lè),譚景和.  動(dòng)物學(xué)報(bào). 2001(06)



本文編號(hào)：3190335