豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV2）近年來在我國呈高發(fā)態(tài)勢，給我養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。PCV2主要入侵淋巴系統(tǒng)引起免疫抑制，臨床上多為隱性感染，常常并發(fā)或繼發(fā)其他病毒或細(xì)菌病。目前，有關(guān)PCV2的疫苗的研究國內(nèi)外多有報道。商品化疫苗仍以滅活疫苗為主，當(dāng)前PCV2的滅活疫苗和弱毒活疫苗在抗原制備、抗體滴度、安全性等方面仍存在一定的不足，PCV2亞單位疫苗和重組疫苗因其安全性、經(jīng)濟性和良好的免疫誘導(dǎo)效果成為近年來成為研究熱點。本研究首先開展我國豬圓環(huán)病毒的流行狀況研究，10個省市300個樣品的檢測結(jié)果顯示，PCV2的陽性率平均為85%（65%～92%），這一結(jié)果表明我國豬群PCV2的感染非常普遍。進一步開展分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國近年來流行的主要毒株基本為PCV2b亞型。本研究檢測的28株毒株中，屬于PCV2b亞型的有27株，占96.4%，屬于PCV2a的有1株，占3.6%。同源進化分析顯示，毒株之間同源性為97.6%～100%，與參考毒株的同源性為88.3%～100%。鑒于此，本研究以分離的2b亞型毒株P(guān)CV2-SL13為參考毒株，采用真核... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
符號說明
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 豬圓環(huán)病毒病簡介
        1.1.1 病原學(xué)特性
            1.1.1.1 病原分類
            1.1.1.2 理化特性
            1.1.1.3 基因型
            1.1.1.4 病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能
        1.1.2 流行病學(xué)
            1.1.2.1 傳染源
            1.1.2.2 傳播途徑
            1.1.2.3 感染機制
    1.2 PCV2 疫苗研究進展
        1.2.1 弱毒苗
        1.2.2 滅活疫苗
        1.2.3 亞單位疫苗
        1.2.4 活載體疫苗
        1.2.5 核酸疫苗
    1.3 研究目的和意義
2 我國部分省市 PCV2 的分子流行病學(xué)研究
    2.1 材料
        2.1.1 病料
        2.1.2 菌種、質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑、試劑盒
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 病料的處理
        2.2.2 引物的設(shè)計
        2.2.3 模板的制備
        2.2.4 PCV2 樣品的 PCR 擴增
        2.2.5 PCV2 全基因的擴增
        2.2.6 PCR 產(chǎn)物回收
        2.2.7 連接
        2.2.8 轉(zhuǎn)化
            2.2.8.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl_2 法)
            2.2.8.2 轉(zhuǎn)化
        2.2.9 陽性重組質(zhì)粒的篩選及鑒定
            2.2.9.1 重組質(zhì)粒的提取
            2.2.9.2 陽性重組質(zhì)粒的鑒定
        2.2.10 PCV2 分子遺傳和變異分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PCV2 Cap 基因 PCR 擴增結(jié)果
        2.3.2 PCV2 的感染和流行狀況分析
        2.3.3 PCV2 全基因組的擴增結(jié)果
        2.3.4 PCV2 全基因組的分子遺傳和變異分析
    2.4 討論和分析
3 pcDNA4/HisMax-Cap 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和免疫效力的研究
    3.1 材料
        3.1.1 毒種、質(zhì)粒、實驗動物
        3.1.2 主要試劑、試劑盒
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 目的基因（PCV2 ORF2）的擴增
        3.2.2 PCR 產(chǎn)物的回收
        3.2.3 PCR 產(chǎn)物與 pMD18-T 載體的連接和轉(zhuǎn)化
        3.2.4 pMD-Cap 和 pcDNA4/HisMax 的雙酶切
        3.2.5 Cap 基因與 pcDNA4/HisMax 的連接
        3.2.6 pcDNA4.0-Cap 重組質(zhì)粒在動物體內(nèi)免疫效力的測定
            3.2.6.1 重組質(zhì)粒的制備
            3.2.6.2 重組質(zhì)粒免疫小鼠
            3.2.6.3 被免小鼠血清中 PCV2 抗體檢測
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 豬圓環(huán)病毒 Cap 基因 PCR 擴增結(jié)果
        3.3.2 PCV2 陽性重組質(zhì)粒的篩選及鑒定
        3.3.3 pMD-Cap 和 pcDNA4/HisMax 的雙酶切
        3.3.4 Cap 基因與載體 pcDNA4/HisMax 的連接
        3.3.5 動物試驗結(jié)果
    3.4 討論和分析
4 PCV2-cap-腺病毒載體構(gòu)建
    4.1 材料
        4.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑、試劑盒
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 目的基因（PCV2-Cap）的擴增
        4.2.2 PCR 產(chǎn)物的回收
        4.2.3 PCR 產(chǎn)物和空載體質(zhì)粒 pacAd5CMVK-NpA Shuttle vector 的雙酶切
        4.2.4 Cap 基因與 pacAd5CMVK-NpA Shuttle vector 的連接
        4.2.5 pShuttle-Cap 與腺病毒骨架載體的線性化
        4.2.6 pShuttle-Cap 與腺病毒骨架載體的共轉(zhuǎn)染
        4.2.7 重組病毒的收獲
        4.2.8 重組病毒的純化
        4.2.9 重組病毒 TCID_50 測定
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 豬圓環(huán)病毒 Cap 基因 PCR 擴增結(jié)果
        4.3.2 Cap 基因和空載體質(zhì)粒腺病毒穿梭載體的雙酶切
        4.3.3 豬圓環(huán)病毒 Cap 基因-腺病毒穿梭載體重組質(zhì)粒的篩選及鑒定
        4.3.4 pShuttle-Cap 與腺病毒骨架載體的共轉(zhuǎn)染
    4.4 討論和分析
5 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]PCV2感染對豬MCP-1和IL-8 mRNA表達(dá)的影響[J]. 周雙海,楊漢春,郭鑫,司興奎,趙東升.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2006(06)
[3]豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定[J]. 王先煒,姜平,李玉峰,蔣文明,湯景元.  Virologica Sinica. 2006(01)
[4]豬2型圓環(huán)病毒核酸疫苗免疫效應(yīng)研究[J]. 宋云峰,肖少波,金梅林,張松林,陳煥春.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2005(10)
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[6]豬2型圓環(huán)病毒ORF1與ORF2基因和偽狂犬病毒基因的重組與表達(dá)的研究[J]. 琚春梅,陳煥春,樊惠英,劉正飛,曹勝波.  生物工程學(xué)報. 2005(03)



本文編號：3188708