日本乙型腦炎（Japanese encephalitis, JE）,簡稱乙腦,是由日本乙型腦炎病毒感染引起的一種蚊媒性人畜共患傳染病。乙腦主要引起神經(jīng)損傷和繁殖障礙,嚴重影響人類健康和養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。免疫接種是目前控制日本乙型腦炎最有效的方法之一。但是目前常用滅活疫苗（P3毒株）和弱毒苗（SA14-14-2毒株）都是基于JEV基因Ⅲ型毒株研制,可能會對目前逐漸流行起來基因Ⅰ型JEV引發(fā)的乙型腦炎的預(yù)防與控制帶來一些問題,研制針對JEV基因Ⅰ型的乙型腦炎疫苗就顯得尤為重要。鑒于此,本研究以偽狂犬病病毒弱毒株TK-/gE-/LacZ+和TK-/gG-/PrM-E+/gE-/eGFP+為載體,構(gòu)建表達基因Ⅰ型JEV的主要免疫原性蛋白PrM-E的重組偽狂犬病病毒,擬達到能夠同時控制乙型腦炎和偽狂犬病病毒病的目的。主要研究內(nèi)容如下：1.表達JEV主要免疫原性基因重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建及免疫效果的研究首先克隆出JEV SX09-S01毒株（基因Ⅰ型）結(jié)構(gòu)蛋白PrM-E的基因序列,通過EcoRⅠ, BglⅡ酶切位點連接于pCA真核表達質(zhì)粒形成pCA-PrM-E。用Sal Ⅰ和BglⅡ酶切質(zhì)粒pCA-P... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表(Abbreviation)
1 文獻綜述
    1.1 流行乙型腦炎的流行病學(xué)特性
    1.2 乙型腦炎病毒的病原學(xué)特征
    1.3 JEV的分子生物學(xué)特征
        1.3.1 基因組結(jié)構(gòu)與功能
        1.3.2 JEV基因組編碼蛋白概況
    1.4 乙型腦炎疫苗的研究進展
        1.4.1 目前投入臨床研究或使用的乙型腦炎疫苗
        1.4.2 實驗室研發(fā)階段乙型腦炎疫苗
    1.5 偽狂犬病以及偽狂犬病毒活載體的研究進展
2 研究目的和意義
3 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 毒株與細胞
        3.1.2 菌株載體與質(zhì)粒
        3.1.3 主要工具酶及試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基及其配制方法
        3.1.5 主要緩沖液與相關(guān)試劑及其配制
        3.1.6 本研究所用PCR引物
        3.1.7 試驗動物及試驗地點
    3.2 實驗方法
        3.2.1 JEV(SX09S-01)毒株的擴增
        3.2.2 JEV(SX09S-01)毒株總RNA提取
        3.2.3 JEV PrM-E基因的RT-PCR擴增
        3.2.4 擴增并回收JEV PrM-E基因
        3.2.5 連接JEV PrM-E片段于pMD18-T載體
        3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、挑菌及培養(yǎng)
        3.2.7 質(zhì)粒的小量制備(OMEGA小提試劑盒)
        3.2.8 質(zhì)粒的大量制備(OMEGA大提試劑盒)
        3.2.9 PRV病毒基因組的提取
        3.2.10 脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染法及空斑純化
        3.2.11 SDS-PAGE分析和Western blot檢測
        3.2.12 遺傳穩(wěn)定性與一步生長曲線
        3.2.13 動物實驗
        3.2.14 實時熒光定量PCR檢測干擾素相對表達水平
4 結(jié)果與分析
    4.1 JEV PrM-E基因的克隆和序列的分析
        4.1.1 JEV PrM-E基因的RT-PCR擴增
        4.1.2 JEV PrM-E基因測序分析
    4.2 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIE-pCA-PrM-E的構(gòu)建
    4.3 重組PRV病毒的構(gòu)建
        4.3.1 重組PRV病毒構(gòu)建策略及初步鑒定
        4.3.2 重組病毒PRV TK-/gE-/PrM-E+的空斑純化及PCR鑒定
        4.3.3 重組病毒PRV TK~-/gG~-/PrM-E~+/gE~-/PrM-E~+的空斑純化及PCR鑒定
    4.4 重組病毒外源蛋白的western blot檢測
    4.5 重組病毒PRV TK~-/gE~-/PrM-E~+遺傳穩(wěn)定性鑒定
    4.6 重組病毒PRV TK~-/gE~-/PrM-E~+一步生長曲線
    4.7 小鼠動物試驗研究
        4.7.1 重組病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的ELISA抗體水平
        4.7.2 重組病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平
        4.7.3 動物保護力實驗
5 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 重組病毒研究
        5.1.2 JEV疫苗研究的展望與設(shè)想
    5.2 結(jié)論
參考文獻
致謝



本文編號：3184182