雙表達系統(tǒng)與單一表達系統(tǒng)相比,具有較大的優(yōu)勢,可以啟動細胞核,同時表達兩外源基因。生長抑素-皮質(zhì)抑素真核雙表達DNA疫苗,可以在真核細胞中同時表達生長抑素-乙肝表面抗原（S/2SS）和皮質(zhì)抑素-乙肝表面抗原（S/CST14）兩種融合蛋白質(zhì),可以刺激機體分別產(chǎn)生抗生長抑素（Somatostatin,SS）和皮質(zhì)抑素（Cortistatin,CST）的兩種抗體,同時中和內(nèi)源性生長抑素和皮質(zhì)抑素,進而促進生長。因此在理論上,生長抑素和皮質(zhì)抑素雙表達DNA疫苗的促生長效果應比單表達DNA疫苗強。本研究應用基因克隆、細胞培養(yǎng)、RT-PCR、細胞免疫熒光、Western blot和ELISA等技術,將皮質(zhì)抑素14肽基因連接在乙肝表面抗原3’端和雙拷貝生長抑素乙肝表面抗原片段克隆到具有IRES元件的雙表達pIRES質(zhì)粒上,構(gòu)建生長抑素-皮質(zhì)抑素真核雙表達質(zhì)粒（pIRES-S/CST14-S/2SS,以下簡稱雙表達質(zhì)粒）。然后,轉(zhuǎn)染Hela和GH3細胞,以鑒定該質(zhì)粒在真核細胞中的表達情況。最后,采用肌肉注射方式將3種濃度的雙表達DNA疫苗免疫4周齡的昆明雌鼠,并以2種單表達質(zhì)粒及其聯(lián)合免疫、以及本實驗... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表(Abbreviation)
第一章 生長抑素和皮質(zhì)抑素雙表達DNA疫苗研究進展
    1 生長抑素生理生化作用及其研究進展
        1.1 生長抑素的生物學特性
        1.2 生長抑素的受體及生物學作用
    2 生長抑素DNA免疫進展及存在的主要問題
        2.1 合成肽生長抑素疫苗
        2.2 基因工程疫苗
        2.3 生長抑素DNA免疫
        2.4 生長抑素DNA免疫效果研究發(fā)展
    3 皮質(zhì)抑素14肽(CST-14)生理生化作用及其研究進展
        3.1 前皮質(zhì)抑素原的克隆
        3.2 前皮質(zhì)抑素原在大腦中表達受到抑制
        3.3 CST-14的生理學性狀
        3.4 皮質(zhì)抑素的受體
        3.5 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的附加功能
    4 基因疫苗免疫的安全性研究進展
        4.1 WHO及FDA對DNA疫苗安全性的有關規(guī)定
        4.2 基因整合的研究
    5 研究目的與意義
第二章 生長抑素和皮質(zhì)抑素雙表達DNA疫苗的構(gòu)建與鑒定
    引言
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果與分析
        2.1 片段S/2SS的PCR擴增產(chǎn)物
        2.2 質(zhì)粒pIRES、PVAX1-S/CST和PVAX1-S/CST14雙酶切產(chǎn)物
        2.3 質(zhì)粒pIRES-S/CST和pIRES-S/CST14的雙酶切產(chǎn)物
        2.4 質(zhì)粒pIRES-S/2SS雙酶切產(chǎn)物
        2.5 質(zhì)粒pIRES-S/CST14 -S/2SS雙酶切產(chǎn)物
        2.6 質(zhì)粒pIRES-S/CST14-S/2SS轉(zhuǎn)染Hela細胞后的RT-PCR轉(zhuǎn)錄
        2.7 質(zhì)粒pIRES-S/CST14-S/2SS轉(zhuǎn)染Hela細胞后的蛋白表達
        2.8 雙表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞后,細胞免疫熒光方法觀察
    3 討論
第三章 雙表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GH3細胞后的分泌作用及其受體表達水平變化
    引言
    1 材料和方法
        1.1 材料
        1.2 方法
        1.3 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果
        2.1 生長抑素和皮質(zhì)抑素在GH3細胞表達
        2.2 細胞凋亡
        2.3 cAMP檢測
        2.4 生長激素和催乳素的檢測
        2.5 生長抑素受體的蛋白表達分析
    3 討論
第四章 雙表達DNA疫苗免疫小鼠的生長及免疫應答效果
    引言
    1 材料和方法
        1.1 質(zhì)粒和菌株
        1.2 實驗動物飼養(yǎng)管理
        1.3 疫苗的免疫及樣品采集
        1.4 實驗試劑及配制
        1.5 小鼠血液采集
        1.6 相關激素和抗體檢測
        1.7 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 小鼠的SS IgG水平檢測
        2.2 免疫后SS抗體陽性小鼠的增重比較
        2.3 GH和CST激素檢測
    3 討論
第五章 生長抑素和皮質(zhì)抑素雙表達DNA疫苗安全性研究
    引言
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果分析
        2.1 小鼠組織總DNA內(nèi)參基因的PCR結(jié)果
        2.2 生長抑素和皮質(zhì)抑素融合目的基因擴增結(jié)果
    3 討論
第六章 基因免疫方法學研究
    引言
    1 材料與方法
        1.1 質(zhì)粒和細菌
        1.2 細菌菌株接種疫苗的制備
        1.3 疫苗的免疫
        1.4 體重數(shù)據(jù)和血清的采集
        1.5 間接ELISA方法檢測抗體水平
        1.6 分析質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及在機體組織中的生物分布
        1.7 提取DNA試劑盒方法步驟
        1.8 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果
        2.1 生長抑素SS的IgG抗體水平
        2.2 抗生長抑素抗體IgG水平
        2.3 IgA抗體水平結(jié)果
        2.4 增重分析
        2.5 小鼠各種組織中質(zhì)粒的拷貝數(shù)及生物分布
    3 討論
全文總結(jié)
創(chuàng)新與不足
參考文獻
附錄Ⅰ: 已發(fā)表論文和專利
附錄Ⅱ: 皮質(zhì)抑素和生長抑素堿基序列
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]新型生長抑素原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及表達鑒定[J]. 梁愛心,馮細鋼,韓麗,滑國華,桑雷,劉興斌,劉耘,楊利國.  生物工程學報. 2008(06)
[2]雙拷貝抑制素基因疫苗pcISI的構(gòu)建和表達及免疫[J]. 曹少先,邢朝芳,張德坤,舒鄧群,楊利國.  畜牧獸醫(yī)學報. 2008(05)
[3]口服生長抑素基因疫苗對小腸局部細胞免疫的影響[J]. 嚴婷,杜念興,楊倩.  免疫學雜志. 2006(S1)
[4]小鼠對pGM-CSF/SS生長抑素基因疫苗的免疫應答[J]. 梁愛心,姚艷豐,金定恩,武睿,韓麗,付平,劉耘,楊利國.  華中農(nóng)業(yè)大學學報. 2006(05)
[5]生長抑素DNA疫苗pEGS/2SS在大鼠體內(nèi)的表達與分布[J]. 曹少先,楊利國,茆達干,張文偉,邢朝芳.  南京農(nóng)業(yè)大學學報. 2005(02)
[6]生長抑素基因疫苗pcS/SS構(gòu)建及其在HeLa細胞中的表達[J]. 曹少先,楊利國,茆達干,張文偉,管峰.  中國獸醫(yī)學報. 2004(02)
[7]生長抑素（SS）與硫氧還原蛋白（Thioredoxin）相融合生成的2種基因工程化融合蛋白SS-N/X和SS-N/S的表達特性[J]. 劉永慶,陳溥言,杜念興,趙國屏.  中國獸醫(yī)學報. 2003(02)
[8]增強以表位為基礎的基因免疫效果的新策略[J]. 徐薇.  上海免疫學雜志. 2002(01)
[9]優(yōu)化基因免疫治療的新進展[J]. 羅紅雨.  國外醫(yī)學(免疫學分冊). 2001(04)
[10]中樞生長抑素作用機制的研究[J]. 沈紅芬.  國外醫(yī)學.精神病學分冊. 2001(01)

博士論文
[1]非抗性篩選生長抑素DNA疫苗的構(gòu)建和免疫效力及安全性研究[D]. 梁愛心.華中農(nóng)業(yè)大學 2009

碩士論文
[1]IL-6與GM-CSF基因融合表達生長抑素基因疫苗對小鼠生長的影響[D]. 趙興華.華中農(nóng)業(yè)大學 2010
[2]口服型生長抑素基因疫苗對小鼠腸道局部免疫效果的研究[D]. 嚴婷.南京農(nóng)業(yè)大學 2006



本文編號：3179758