犬皰疹病毒（Canine herpesvirus,CHV）感染僅存在于犬中,是新生幼犬的急性、非發(fā)熱型致死性疾病。由US6基因編碼的gD糖蛋白是皰疹病毒囊膜上的重要組成部分,它具有識別各自紅細胞的能力,使各個皰疹病毒都有自己的特征。因此,本研究根據(jù)自然發(fā)病犬的臨床癥狀、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）、病毒的分離和純化、動物回歸實驗和基因生物信息學(xué)分析的實驗手段證實了該疾病為CHV感染所致,另外,對US6基因編碼的gD糖蛋白的主要抗原區(qū)域進行分析并構(gòu)建了表達載體。試驗結(jié)果如下:1.從病犬肝臟中提取的DNA經(jīng)PCR擴增,檢測出大小為357 bp的目的條帶,經(jīng)NCBI的Blast比對驗證該病毒為CHV,毒株命名為CHV-JX株,并測得該病毒的TCID₅₀為10^-4.39/0.1mL;該病毒感染的犬腎細胞（Madin-Darby canine kidney,MDCK）在電鏡下可看到圓形的病毒粒子,細胞出現(xiàn)了空泡化;在顯微鏡下,可以看到24h內(nèi)細胞開始出現(xiàn)圓縮、變暗,逐漸向周圍擴散,最后細胞脫落。將CHV-J... 

【文章來源】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 皰疹病毒
        1.1.1 皰疹病毒的形態(tài)特征
        1.1.2 皰疹病毒基因編碼的蛋白
        1.1.3 皰疹病毒的復(fù)制
    1.2 犬皰疹病毒概述
        1.2.1 病原學(xué)
        1.2.2 流行病學(xué)
        1.2.3 臨床癥狀
        1.2.4 病理學(xué)特征
        1.2.5 診斷方法
        1.2.6 治控方案
    1.3 研究的目的及意義
第二章 犬皰疹病毒的分離鑒定
    2 實驗方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 樣本來源
            2.1.2 細胞
            2.1.3 質(zhì)粒及菌株
            2.1.4 引物
            2.1.5 試劑與耗材
            2.1.6 儀器設(shè)備
        2.2 犬皰疹病毒的分離鑒定
            2.2.1 病毒的分離培養(yǎng)
            2.2.2 細胞的復(fù)蘇
            2.2.3 MDCK傳代細胞培養(yǎng)法
            2.2.4 細胞的凍存
            2.2.5 細胞攻毒及病毒的繁殖
            2.2.6 MDCK細胞半數(shù)感染量(TCID50)的測定
            2.2.7 病毒的鑒定
        2.3 幼犬回歸試驗
        2.4 犬皰疹病毒對MDCK細胞的影響
    3 實驗結(jié)果
        3.1 PCR檢測結(jié)果
        3.2 犬腎細胞半數(shù)感染量(TCID50)結(jié)果
        3.3 感染細胞電鏡結(jié)果
        3.4 細胞病變結(jié)果
        3.5 幼犬回歸試驗結(jié)果
        3.6 CHV對MDCK細胞的影響
            3.6.1 CHV對MDCK細胞凋亡的影響
            3.6.2 CHV對MDCK細胞線粒體膜電位的影響
            3.6.3 CHV對MDCK細胞ROS的影響
            3.6.4 CHV對MDCK細胞p H值的影響
    4 討論
        4.1 犬皰疹病毒的流行病學(xué)特點
        4.2 皰疹病毒對MDCK細胞的損傷
第三章 犬皰疹病毒US6基因的生物信息學(xué)分析
    3.
        3.1 試劑準備
        3.2 US6全基因擴增
        3.3 PCR產(chǎn)物的膠回收純化
        3.4 構(gòu)建重組質(zhì)粒
            3.4.1 連接
            3.4.2 轉(zhuǎn)化
            3.4.3 提取重組質(zhì)粒
        3.5 犬皰疹病毒US6基因的序列分析
        3.6 US6基因的核苷酸序列的同源性分析
        3.7 US6基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析
        3.8 gD蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.9 gD蛋白的抗原性分析
        3.10 犬皰疹病毒gD蛋白主要抗原區(qū)域的原核表達載體的制備
    4 實驗結(jié)果
        4.1 US6全基因凝膠電泳結(jié)果
        4.2 gD蛋白保守區(qū)域分析結(jié)果
        4.3 US6基因遺傳進化樹和同源性分析結(jié)果
        4.4 US6基因的核苷酸序列校對后ORF預(yù)測結(jié)果
        4.5 gD蛋白氨基酸序列的信號肽預(yù)測
        4.6 gD蛋白氨基酸序列的跨膜區(qū)域預(yù)測
        4.7 gD蛋白氨基酸序列的N糖基化位點預(yù)測
        4.8 gD蛋白氨基酸序列抗原性分析
        4.9 犬皰疹病毒主要抗原區(qū)域的表達
            4.9.1 犬皰疹病毒CHV-JX株US6基因主要抗原區(qū)域的全基因合成
            4.9.2 主要抗原區(qū)域的全基因合成及表達載體的構(gòu)建與鑒定
    5 討論
第四章 結(jié)論
參考文獻
文章的創(chuàng)新與不足
攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]α皰疹病毒潛伏感染研究進展[J]. 向廣韜,吳紅霞,仇華吉,孫元.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2018(10)
[2]鎘通過引發(fā)氧化應(yīng)激和線粒體損傷誘導(dǎo)PK-15細胞凋亡[J]. 董峰,楊佳,李向陽,吳瓊,張少英,王蘭.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2018(11)
[3]BRD7對過氧化氫處理的心肌細胞線粒體膜電位和胞漿中Cyt C蛋白水平影響研究[J]. 李春曉,李艷,張靜靜,張勇濤,楊杰書.  中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志. 2018(10)
[4]魚類病毒誘導(dǎo)細胞凋亡機制研究進展[J]. 周廣舟,孫彥鶴,郭爽爽.  動物醫(yī)學(xué)進展. 2018(09)
[5]pH值對人退變椎間盤髓核細胞凋亡的影響[J]. 楊召,苑珍珍,張楊,郭悅,馬劍雄,馬信龍.  中國矯形外科雜志. 2018(01)
[6]貓皰疹病毒1型部分糖蛋白的研究進展[J]. 張繼一,王竹,劉寶山.  養(yǎng)殖技術(shù)顧問. 2013(05)
[7]貓皰疹病毒Ⅰ型的分離與鑒定[J]. 張碩,李純玲,汪葆玥,劉金華,田克恭.  實驗動物科學(xué). 2010(02)
[8]蛋白質(zhì)糖基化修飾研究進展[J]. 李軍,杜鑫,Hosseini Moghaddam S.H.,陳玉銀.  科技通報. 2009(06)
[9]皰疹病毒gC基因及其編碼蛋白研究進展[J]. 練蓓,程安春,汪銘書.  中國動物傳染病學(xué)報. 2009(02)
[10]單純皰疹病毒的復(fù)制組裝機制[J]. 黎庶,胡福泉.  微生物學(xué)免疫學(xué)進展. 2009(01)

碩士論文
[1]新疆伊犁地區(qū)馬皰疹病毒1型的分離鑒定及其gB和gD基因的序列分析[D]. 楊永龍.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]皰疹病毒通過抑制組蛋白H1.2的表達來阻止宿主細胞的凋亡[D]. 高海霞.安徽大學(xué) 2014
[3]雞傳染性喉氣管炎病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立和亞單位疫苗研制[D]. 郭建友.揚州大學(xué) 2014
[4]基于主成分分析和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)糖基化位點的預(yù)測[D]. 何偉.中南林業(yè)科技大學(xué) 2010
[5]偽狂犬病毒Ea株主要衣殼蛋白之間的相互作用研究[D]. 薛念波.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號：3172183