乳酸菌（Lactic Acid Bacteria,LAB）是一類以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的厭氧菌。早在幾百年前,人們就利用乳酸菌生產(chǎn)酸奶等發(fā)酵食品,其安全特性已經(jīng)被廣泛認(rèn)可。近年來,乳酸菌作為重組蛋白口服載體疫苗的潛力也備受關(guān)注。在過去的二十年中,許多乳酸菌菌株的生理學(xué)和遺傳學(xué)特性已經(jīng)被徹底地研究,一些菌株已經(jīng)完成全基因組測序,并且開發(fā)出了多種基于乳酸乳球菌的遺傳表達(dá)工具,其中NICE基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)（Nisin-controlled gene expression system,NICE）就是一種簡便、可控的表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)通過納克量級的nisin（來自乳酸菌自身的一種34個氨基酸的天然細(xì)菌素）即可激活并誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),因此,該系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白;此外,乳酸菌還有非誘導(dǎo)的組成型持續(xù)表達(dá)系統(tǒng)等。但是與相對成熟的酵母和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比,乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)普遍存在表達(dá)量不足、難以分泌等劣勢,不利于重組乳酸菌的構(gòu)建和外源目的蛋白的表達(dá)。本研究獨(dú)創(chuàng)性地采用由NICE誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和組成型持續(xù)表達(dá)系統(tǒng)組成的雙啟動子串聯(lián)表達(dá)策略,構(gòu)建了由單一質(zhì)粒攜帶雙啟動子串聯(lián)表達(dá)同一目的蛋白的新... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 乳酸菌概述
    1.2 乳酸菌作為載體
        1.2.1 菌株的選擇
        1.2.2 表達(dá)方式的選擇
        1.2.3 沙門氏菌侵襲蛋白RCK
        1.2.4 乳酸菌作為載體的展望
    1.3 傳染性法氏囊病(IBD)
        1.3.1 IBD概述
        1.3.2 IBD流行病學(xué)
        1.3.3 IBD疫苗研究現(xiàn)狀
    1.4 目的與意義
第二章 R-L.LACTIS-PGSA-VP2-RCK重組乳酸菌的構(gòu)建及其免疫效果的評價
    2.1 材料
        2.1.1 質(zhì)粒、菌株、毒株及實驗動物
        2.1.2 主要試劑和儀器
    2.2 方法
        2.2.1 引物合成
        2.2.2 目的片段擴(kuò)增
        2.2.3 目的片段的膠回收純化
        2.2.4 NZ3900 感受態(tài)的制備
        2.2.5 重組質(zhì)粒pNZ8149-pgsA-VP2-RCK構(gòu)建
        2.2.6 電轉(zhuǎn)化構(gòu)建r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重組乳酸菌
        2.2.7 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重組乳酸菌的篩選鑒定
        2.2.8 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重組乳酸菌的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.9 間接免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)鑒定蛋白錨定
        2.2.10 動物實驗設(shè)計
        2.2.11 血清抗體滴度檢測
        2.2.12 血清中和抗體的檢測
        2.2.13 攻毒保護(hù)率
        2.2.14 統(tǒng)計學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 目的基因片段的擴(kuò)增
        2.3.2 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重組乳酸菌的篩選及PCR鑒定
        2.3.3 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重組乳酸菌的酶切鑒定
        2.3.4 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重組乳酸菌的蛋白表達(dá)情況
        2.3.5 間接免疫熒光鑒定重組乳酸菌表面錨定目的蛋白
        2.3.6 流式細(xì)胞分析鑒定重組乳酸菌表面錨定目的蛋白
        2.3.7 血清ELISA抗體與中和抗體的檢測結(jié)果
        2.3.8 攻毒保護(hù)率
    2.4 討論
第三章 R-L.LACTIS-PNISA+P45-VP2-RCK重組乳酸菌的構(gòu)建及其免疫效果的評價
    3.1 材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株、毒株及實驗動物
        3.1.2 主要試劑和儀器
    3.2 方法
        3.2.1 引物合成
        3.2.2 目的片段擴(kuò)增
        3.2.3 重組質(zhì)粒pNZ8149-pnisA+p45-VP2-RCK的構(gòu)建
        3.2.4 電轉(zhuǎn)化構(gòu)建r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重組乳酸菌
        3.2.5 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重組乳酸菌的篩選鑒定
        3.2.6 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重組乳酸菌的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.7 動物實驗設(shè)計
        3.2.8 血清抗體滴度檢測
        3.2.9 血清中和抗體檢測
        3.2.10 攻毒保護(hù)率
        3.2.11 法氏囊指數(shù)統(tǒng)計
        3.2.12 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 目的基因片段的擴(kuò)增
        3.3.2 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重組乳酸菌的篩選及PCR鑒定
        3.3.3 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重組乳酸菌酶切鑒定
        3.3.4 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重組乳酸菌蛋白表達(dá)情況
        3.3.5 血清ELISA抗體與中和抗體的檢測結(jié)果
        3.3.6 攻毒保護(hù)率
        3.3.7 法氏囊指數(shù)統(tǒng)計
    3.4 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]雞傳染性法氏囊病的研究進(jìn)展[J]. 李潭清,宋勤葉,楊潤德,高軒,劉蘭亞.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(35)
[3]乳酸菌作為口服疫苗載體的研究進(jìn)展[J]. 余麗蕓,王桂華,唐彥君.  生物技術(shù)通報. 2008(05)
[4]傳染性法氏囊病及其病原分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 何秀苗,陽秀英,韋平.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2007(02)
[5]Vaccination against Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus Using Recombinant T4 Bacteriophage Displaying Viral Protein VP2[J]. Yong-Chang CAO Quan-Cheng SHI Jing-Yun MA Qing-Mei XIE Ying-Zuo BI Genetic Engineering Laboratory,Animal Science College,South China Agricultural University,Guangzou 510642,China.  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(10)
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本文編號：3164012