為研究一種簡單快速分離蒙古馬睪丸支持細胞并保證其活性的基本方法,本試驗采集2歲蒙古馬睪丸組織于低溫環(huán)境下進行機械分離,將1～3 g睪丸組織剪碎,采用重力沉淀法去除游離的紅細胞和間質(zhì)細胞;使用0.1%膠原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步進行組織消化,并用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng);在接種后采用差異貼壁法分離純化支持細胞,使用Tris-HCl低滲法去除雜質(zhì)細胞,并采用堿性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、實時熒光定量PCR方法進行鑒定。結(jié)果顯示,支持細胞貼壁性能較強,培養(yǎng)24 h后大多數(shù)細胞開始貼壁,細胞形狀呈橢圓形;培養(yǎng)48 h后胞質(zhì)增多,折光性變強;培養(yǎng)3～4 d細胞胞質(zhì)展開緊密連接,此時細胞呈三角形,有明顯的核仁,培養(yǎng)6～7 d細胞生長狀態(tài)進入穩(wěn)定期。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,GATA4和GDNF基因在培養(yǎng)細胞中極顯著表達（P<0.01）,AKP染色支持細胞呈陰性表達,表明分離培養(yǎng)的細胞確為支持細胞。本試驗使用機械分離法與兩步酶消化法處理組織,可快速高效地獲得睪丸支持細胞,成功構(gòu)建了蒙古馬睪丸支持細胞體外培養(yǎng)方法。 

【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2020,47(09)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 支持細胞組織的提取
    1.3 支持細胞的純化與傳代培養(yǎng)
    1.4 支持細胞形態(tài)學鑒定
    1.5 支持細胞堿性磷酸酶染色觀察
    1.6 蒙古馬睪丸支持細胞生長曲線測定
    1.7 實時熒光定量PCR鑒定
2 結(jié) 果
    2.1 蒙古馬支持細胞體外分離培養(yǎng)特征
    2.2 支持細胞生長曲線繪制
    2.3 支持細胞標志基因檢測分析
3 討 論
    3.1 支持細胞體外培養(yǎng)
    3.2 支持細胞的鑒定方法
4 結(jié) 論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]MDCK細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)的生長特性研究[J]. 竇曉霞,馬桂蘭,喬自林,王家敏,李倬.  甘肅畜牧獸醫(yī). 2019(04)
[2]支持細胞功能狀態(tài)調(diào)控精子發(fā)生的研究進展[J]. 李丹婷,白利鵬,蔡欣,余樹民.  中華男科學雜志. 2018(09)
[3]成年小鼠睪丸支持細胞體外快速分離與培養(yǎng)[J]. 胡旭燕,伍瓊芳,張學宏.  江西醫(yī)藥. 2018(03)
[4]大鼠睪丸支持細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J]. 張倩,周可柔,胡倩倩,任曼,靳二輝,顧有方,李升和.  安徽科技學院學報. 2018(02)
[5]和田羊睪丸支持細胞的體外培養(yǎng)與分離鑒定[J]. 王帥,賈琦珍,張玲,王連群,陳根元.  西南農(nóng)業(yè)學報. 2017(08)
[6]大鼠睪丸支持細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J]. 丁天云,張明,楊洋,簡少卿,陽剛,胡寶慶,文春根.  南昌大學學報(理科版). 2016(05)
[7]睪丸支持細胞對精原干細胞作用因子研究進展[J]. 鄧偉民,孫大林,金保方.  中國男科學雜志. 2015(12)
[8]犢牛睪丸生殖干細胞與支持細胞體外共培養(yǎng)體系的建立[J]. 張倩,齊曉楠,楊文浩,叢霞,李華濤,曹榮峰,田文儒.  動物醫(yī)學進展. 2015(11)
[9]仔豬睪丸支持細胞的體外生物學特性研究[J]. 劉歡歡,余樹民,夏娟,孫成亮,沈留紅,曹隨忠,左之才,馬曉平.  中國細胞生物學學報. 2015(08)
[10]成年犬睪丸支持細胞體外分離培養(yǎng)的研究[J]. 葛秀國,張偉,丁向彬,李吉霞.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2014(15)

碩士論文
[1]支持細胞通過外泌體途徑維持精原干細胞存活的研究[D]. 杜健.西北農(nóng)林科技大學 2017
[2]小鼠精原干細胞、支持細胞體外培養(yǎng)及白消安毒性影響研究[D]. 梁洺源.吉林農(nóng)業(yè)大學 2016
[3]Gata4和Gata6在尼羅羅非魚類固醇生成和配子發(fā)生中作用研究[D]. 何雪.西南大學 2015



本文編號：3160326