隱孢子蟲是一種危害嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,它主要造成宿主不同程度的腹瀉,其寄生范圍很廣,能感染包括人在內(nèi)的260多種脊椎動物。研究發(fā)現(xiàn),野生動物是隱孢子蟲重要儲存宿主,目前研究人員已在不同種類的野生動物身上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)蟲種。本實(shí)驗(yàn)嘗試采用飽和蔗糖漂浮法,從兩個(gè)黑熊養(yǎng)殖場、成都動物園、碧峰峽野生動物園、貴陽動物園、竹鼠養(yǎng)殖場的野生動物和從成都及雅安地區(qū)的大熊貓采集到的共1370份糞便樣品中分離隱孢子蟲；結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子方法對其進(jìn)行蟲種鑒定,再分別采用MLST技術(shù)和gp60位點(diǎn)進(jìn)行亞型鑒定；并對各基因位點(diǎn)測序獲得的序列進(jìn)行同源性分析和構(gòu)建進(jìn)化樹,研究卵囊所屬種類和基因分型地位。結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)共分離得到一株駱駝源隱孢子蟲和三株竹鼠源隱孢子蟲。分離得到的駱駝源隱孢子蟲卵囊在飽和蔗糖溶液中呈現(xiàn)淡紫色,殘留體透明卵囊呈圓形或卵圓形。400×光鏡下平均每個(gè)視野可觀察到3個(gè)卵囊,測量50個(gè)卵囊其平均大小為7.03（5.87-7.95）×5.50（4.60～6.00）μm（n=50）。運(yùn)用巢式PCR擴(kuò)增出駱駝源隱孢子蟲SCBC02分離株18SrRNA、COWP、CpA135三個(gè)基因位點(diǎn)序列,測序結(jié)果經(jīng)矯正... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    1 隱孢子蟲簡介
    2 隱孢子蟲的分類學(xué)和遺傳多態(tài)性
    3 隱孢子蟲的分子鑒定方法
    4 野生動物隱孢子蟲研究現(xiàn)狀
    5 駱駝隱孢子蟲研究進(jìn)展
    6 竹鼠隱孢子蟲研究進(jìn)展
第一章 野生動物隱孢子蟲的檢測與分離
    1 材料和方法
        1.1 主要試劑和儀器
        1.2 糞便樣品采集
        1.3 檢測方法
    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.1 隱孢子蟲檢出率
        2.2 隱孢子蟲卵囊形態(tài)觀察
    3 討論
第二章 駱駝源隱孢子蟲種系發(fā)育分析和動物交叉感染實(shí)驗(yàn)
    1 材料和方法
        1.1 主要試劑和儀器
        1.2 駱駝源隱孢子蟲樣品收集和處理
        1.3 卵囊DNA提取
        1.4 18S rRNA、COWP、CpA135基因PCR擴(kuò)增
            1.4.1 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成
            1.4.2 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
            1.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
            1.4.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序及序列提交
        1.5 MLST技術(shù)亞型鑒定
            1.5.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成
            1.5.2 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
            1.5.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測及測序
        1.6 序列分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建
            1.6.1 Genbank相關(guān)序列搜索與下載
            1.6.2 進(jìn)化樹的構(gòu)建
        1.7 駱駝源隱孢子蟲的動物交叉感染試驗(yàn)
            1.7.1 交叉感染實(shí)驗(yàn)動物
            1.7.2 接種方法與接種劑量
            1.7.3 糞便監(jiān)測
    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果
        2.2 測序結(jié)果
        2.3 交叉感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4 同源性分析
        2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析
    3 討論
第三章 竹鼠源隱孢子蟲的分離鑒定和種系發(fā)育分析
    1 材料和方法
        1.1 主要試劑和儀器
        1.2 竹鼠源隱孢子蟲樣品收集和處理
        1.3 卵囊DNA提取
        1.4 18S rRNA、COWP、HSP70、CpA135、gp60、actin基因PCR擴(kuò)增
            1.4.1 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成
            1.4.2 PCR反應(yīng)體系及與反應(yīng)條件
            1.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
            1.4.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序
            1.4.5 actin位點(diǎn)克隆
            1.4.6 序列分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建
    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果
        2.2 actin克隆結(jié)果
        2.3 測序結(jié)果
        2.4 同源性分析
        2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析
    3 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄一
附錄二
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄



本文編號：3158048