副豬嗜血桿菌（H.parasuis）是豬格拉瑟氏（Gl sser’s）病的病原體，該病主要癥狀為心包炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、纖維素性多發(fā)性漿膜炎和腦膜炎，也可引起敗血癥或無多發(fā)性漿膜炎的肺炎，并可以從健康豬的鼻腔分離到。Gl sser’s病可導(dǎo)致非免疫豬群的高發(fā)病率和高死亡率，是導(dǎo)致保育仔豬發(fā)病和死亡的重要原因之一，H.parasuis已成為國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)的重要致病菌，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成較高的經(jīng)濟(jì)損失。目前免疫組化技術(shù)（IHC）、寡核苷酸特異性捕捉平板雜交實(shí)驗(yàn)（OSCPH）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法已應(yīng)用于H.parasuis病原學(xué)檢測(cè)，補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（CFT）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、間接血凝實(shí)驗(yàn)（IHA）也已應(yīng)用于H.parasuis血清學(xué)檢測(cè)。但利用H.parasuis全菌制備的多克隆抗體（PcAb）因難以避免種間保守蛋白干擾，仍存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象；此外，基于16SrDNA的分子診斷技術(shù)也難以避免吲哚放線桿菌（A. indolicus）的干擾�？傊�，對(duì)H.parasuis特異性的抗原蛋白或核苷酸序列了解的匱乏造成了上述診斷方法在實(shí)際應(yīng)用中受阻，鑒定種內(nèi)保守而種間特異的抗原和抗原表位就... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 副豬嗜血桿菌概述
        1.1.1 病原學(xué)特點(diǎn)
        1.1.2 發(fā)病機(jī)理
        1.1.3 流行病學(xué)特點(diǎn)
    1.2 H.parasuis 感染的診斷方法的研究進(jìn)展
    1.3 H.parasuis 與毒力相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展
    1.4 研究的目的和意義
第二章 H.parasuis MAb 的篩選及鑒定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞、菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要試劑與儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 動(dòng)物的免疫
        2.2.2 間接 ELISA 檢測(cè)方法的建立
        2.2.3 SP2/0 細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2.4 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備
        2.2.5 脾細(xì)胞的制備及細(xì)胞融合
        2.2.6 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆
        2.2.7 陽性雜交瘤細(xì)胞株的保種和復(fù)蘇
        2.2.8 MAb 腹水的制備及效價(jià)測(cè)定
        2.2.9 MAb 亞型的鑒定
        2.2.10 雜交瘤細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)
        2.2.11 MAb Western blot 鑒定
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 間接 ELISA 方法最佳工作條件的建立
        2.3.2 雜交瘤細(xì)胞株的制備及 MAb 亞型的鑒定
        2.3.3 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
        2.3.4 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果
        2.3.5 MAb Western blot 檢測(cè)
    2.4 討論
第三章 MAb 1B3 識(shí)別蛋白的捕獲及抗原表位的初步定位
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 MAb 1B3 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（IP）
        3.2.2 免疫印跡分析
        3.2.3 MAb 1B3 識(shí)別蛋白的質(zhì)譜鑒定
        3.2.4 MAb 1B3 的純化
        3.2.5 肽庫的第 1 輪淘選
        3.2.6 噬菌體的擴(kuò)增
        3.2.7 噬菌體的滴度測(cè)定
        3.2.8 噬菌體的第 2、3 輪淘選
        3.2.9 測(cè)序模板制備及其序列測(cè)定
        3.2.10 噬菌體 ELISA
        3.2.11 HPS-5 的 oppA 基因的測(cè)序
        3.2.12 抗原表位的初步定位
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 菌體蛋白的 IP 及 Western blot 鑒定
        3.3.2 質(zhì)譜鑒定
        3.3.3 淘選產(chǎn)率
        3.3.4 噬菌體 ELISA 檢測(cè)結(jié)果
        3.3.5 HPS-5 的 oppA 基因的測(cè)序
        3.3.6 DNA 序列測(cè)定及表位分析
    3.4 討論
第四章 OppA 蛋白的反應(yīng)原性驗(yàn)證
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 細(xì)胞、菌株
        4.1.2 主要試劑與儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 oppA 基因片段的克隆
        4.2.2 pET-oppA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.3 pET-oppA 重組蛋白的原核表達(dá)及 Western blot 鑒定
        4.2.4 抗原表位的精確定位及表位多肽的反應(yīng)原性檢測(cè)
        4.2.5 OppA 蛋白的一致性分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 oppA 基因的擴(kuò)增
        4.3.2 重組蛋白的表達(dá)及鑒定
        4.3.3 抗原表位的精確定位及表位多肽的反應(yīng)原性檢測(cè)
        4.3.4 OppA 蛋白的一致性分析
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷



本文編號(hào)：3156830