防御素（Defensin）是一類廣泛分布于動物和植物界，富含精氨酸和半胱氨酸殘基的陽離子內(nèi)源性抗微生物肽，具有廣泛的生物學(xué)活性，可抗細(xì)菌、囊膜病毒等多種病原微生物，并且具有不誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的特性。此外，防御素還具有免疫調(diào)節(jié)功能。因此，防御素被認(rèn)為是一種新型抗生素，作為抗感染制劑具有廣闊的應(yīng)用前景。本論文首先構(gòu)建了豬β-防御素-1（Porcineβ-defensin-1, PBD-1）原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)了重組PBD-1，然后通過體內(nèi)外試驗(yàn)檢測了重組PBD-1的抗微生物活性，旨在為進(jìn)一步研發(fā)新型治療制劑奠定基礎(chǔ)。應(yīng)用RT-PCR獲得了長為247bp的PBD-1全基因序列，首先構(gòu)建了重組克隆載體pGM-T-PBD-1，進(jìn)而構(gòu)建了表達(dá)PBD-1成熟肽的重組表達(dá)載體PET-32a-PBD-1。然后在大腸桿菌BL21細(xì)胞中成功表達(dá)了24.5kDa的重組PBD-1。利用6×His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化重組PBD-1，獲得了純化的重組PBD-1。體外試驗(yàn)證明重組PBD-1對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、葡萄球菌和巴氏桿菌均具有不同程度的抗菌活性，隨著重組PBD-1濃度的升高，抗菌活性隨之增強(qiáng)。重組P... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 防御素概述
        1.1.1 防御素的分類
        1.1.2 防御素的生物學(xué)活性
        1.1.3 防御素作用機(jī)理
        1.1.4 防御素基因的重組表達(dá)
        1.1.5 防御素的應(yīng)用
    1.2 研究內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.2.1 研究內(nèi)容
        1.2.2 技術(shù)路線
    1.3 研究目的與意義
    1.4 研究目標(biāo)
    技術(shù)路線
2 材料
    2.1 毒株、菌株與載體
    2.2 實(shí)驗(yàn)用動物
    2.3 主要試劑
        2.3.1 RNA 提取試劑
        2.3.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化用溶液
        2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳用溶液
        2.3.4 誘導(dǎo)表達(dá)用液
        2.3.5 SDS-PAGE 電泳用溶液
        2.3.6 蛋白純化回收和脫鹽用液
        2.3.7 Western blot 用液
        2.3.8 細(xì)胞培養(yǎng)用溶液
        2.3.9 其它試劑
    2.4 主要儀器
3 方法
    3.1 引物設(shè)計(jì)與合成
    3.2 豬β-防御素-1 前體基因克隆載體的構(gòu)建和鑒定
        3.2.1 豬總 RNA 分離提取
        3.2.2 RT-PCR
        3.2.3 豬β-防御素-1 前體基因 PCR 產(chǎn)物的純化和回收
        3.2.4 豬β-防御素-1 前體基因和 pGM-T 載體的連接
        3.2.5 大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備-CaCl2法
        3.2.6 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.2.7 重組質(zhì)粒 DNA 的提取
        3.2.8 重組質(zhì)粒酶切鑒定
        3.2.9 重組質(zhì)粒 pGM-T-PBD-1 序列測定
    3.3 豬β-防御素-1 成熟肽基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
        3.3.1 豬β-防御素-1 成熟肽基因 PCR 擴(kuò)增和純化回收
        3.3.2 豬β-防御素-1 成熟肽基因和表達(dá)載體 PET-32a（+）的酶切
        3.3.3 豬β-防御素-1 成熟肽基因和 PET-32a（+）載體的連接
        3.3.4 重組表達(dá)載體 PET-32a（+）-PBD-1 的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取
        3.3.5 重組表達(dá)載體 PET-32a（+）-PBD-1 的鑒定
        3.3.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 BL21 的制備
        3.3.7 重組表達(dá)載體 PET-32a（+）-PBD-1 轉(zhuǎn)化
    3.4 重組表達(dá)菌的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.4.1 重組表達(dá)菌的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.4.2 最佳表達(dá)條件的確定
        3.4.3 重組 PBD-1 的可溶性檢測
    3.5 重組豬β-防御素-1 的純化回收和脫鹽
        3.5.1 純化回收
        3.5.2 凝膠過濾法脫鹽
        3.5.3 冷凍干燥
    3.6 重組豬β-防御素-1 的 Western blot 鑒定
    3.7 重組豬β-防御素-1 的抗微生物活性檢測
        3.7.1 抗菌活性檢測
        3.7.2 抗病毒活性檢測
    3.8 動物試驗(yàn)
        3.8.1 試驗(yàn)動物分組與感染
        3.8.2 治療
        3.8.3 肉眼病變檢測
        3.8.4 顯微鏡檢測
4 結(jié)果與分析
    4.1 豬β-防御素-1 基因的克隆
        4.1.1 豬β-防御素-1 全基因的 PCR 擴(kuò)增
        4.1.2 豬β-防御素-1 克隆載體 pGM-T-PBD-1 的鑒定
        4.1.3 序列測定結(jié)果
    4.2 豬β-防御素-1 重組表達(dá)載體 PET-32a-PBD-1 的構(gòu)建
    4.3 重組豬β-防御素-1 的表達(dá)及其最佳表達(dá)條件
        4.3.1 重組豬β-防御素-1 的表達(dá)
        4.3.2 最佳表達(dá)條件
        4.3.3 表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在
    4.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化和脫鹽回收
        4.4.1 純化
        4.4.2 脫鹽回收
        4.4.3 冷凍干燥
    4.5 重組豬β-防御素-1 的 Western blot 鑒定
    4.6 重組豬β-防御素-1 抗微生物活性
        4.6.1 對常見細(xì)菌具有抑制活性
        4.6.2 對 PEDV 和禽流感病毒 H9N2 具有抑制活性
    4.7 動物試驗(yàn)
        4.7.1 臨床癥狀
        4.7.2 體重
        4.7.3 感染率和死亡率
        4.7.4 病理變化
        4.7.5 病原分離與鑒定
5 討論
    5.1 重組 PBD-1 克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建
    5.2 重組 PBD-1 的表達(dá)、純化、脫鹽和冷凍干燥處理
    5.3 重組 PBD-1 體外試驗(yàn)
    5.4 動物試驗(yàn)
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及獲得的獎勵
作者簡介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[2]增強(qiáng)人α防御素3殺菌效率的研究[D]. 周立強(qiáng).上海交通大學(xué) 2007



本文編號：3155377