口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouthdisease virus, FMDV）引起的偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病的流行嚴(yán)重影響了畜產(chǎn)品市場(chǎng)與進(jìn)出口貿(mào)易，因而受到世界各國(guó)的高度重視。我國(guó)對(duì)FMD的防控主要采取疫苗免疫和抗體監(jiān)測(cè)為主的綜合防控措施，F(xiàn)MD感染的快速診斷、免疫效果的評(píng)價(jià)與自然感染和疫苗免疫動(dòng)物的鑒別診斷是口蹄疫防控的核心技術(shù)。本研究為鑒定一株口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3A的單克隆抗體3A24#所識(shí)別的表位區(qū)，對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白3A分兩個(gè)肽段進(jìn)行原核表達(dá)，其中3A1和3A2肽段分別包含3A蛋白的第1⁸9位和77¹53位氨基酸。分別針對(duì)兩個(gè)肽段基因設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增后克隆到原核表達(dá)載體pET-30a（+）-PES-SUMO，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21（DE3）pLys，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。用單克隆抗體3A24#對(duì)表達(dá)的3A1和3A2肽段進(jìn)行western blot檢測(cè)，以鑒定單抗3A24#的識(shí)別表位肽。SDS-PAGE分析表明，本試驗(yàn)成功表達(dá)了... 

【文章來(lái)源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁(yè)數(shù)】：52 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
縮略語(yǔ)
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    1 研究目的與意義
    2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展
        2.1 口蹄疫病毒基因組的基本結(jié)構(gòu)和功能
        2.2 口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
        2.3 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
        2.4 口蹄疫病毒抗原表位的研究進(jìn)展
        2.5 口蹄疫 ELISA 檢測(cè)方法的研究進(jìn)展
            2.5.1 ELISA 在口蹄疫抗原表位研究中的應(yīng)用
            2.5.2 ELISA 用于感染動(dòng)物與免疫動(dòng)物的鑒別診斷
            2.5.3 單克隆抗體在 ELISA 中的應(yīng)用
        2.6 ELISA 技術(shù)的發(fā)展前景
第二篇 研究?jī)?nèi)容
    第一章 一株 3A 單抗識(shí)別表位的初步鑒定
        1 材料
            1.1 菌株、載體和質(zhì)粒等
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 3A 肽段基因的 PCR 擴(kuò)增
                2.1.1 引物設(shè)計(jì)
                2.1.2 擴(kuò)增 3a1 和 3a2 基因
                2.1.3 PCR 產(chǎn)物的回收與純化
                2.1.4 PCR 產(chǎn)物與 pET-30a 載體的雙酶切
                2.1.5 目的基因與載體的連接
                2.1.6 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞
                2.1.7 重組質(zhì)粒的提取與測(cè)序
            2.2 融合 3A 肽段的誘導(dǎo)表達(dá)
                2.2.1 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
                2.2.2 表達(dá)肽段的 SDS-PAGE 檢測(cè)
            2.3 表位肽的 western blot 鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 3a1 和 3a2 肽段基因的 PCR 擴(kuò)增
            3.2 融合 3A1、3A2 肽段的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.3 表位肽的 Western blot 鑒定
        4 討論
    第二章 3A 單抗阻斷 ELISA 方法的建立
        1 材料
            1.1 蛋白及抗體
            1.2 主要試劑
            1.3 標(biāo)準(zhǔn)血清
            1.4 血清樣品的背景
            1.5 主要儀器
        2 方法
            2.1 非結(jié)構(gòu)蛋白 2C 多克隆抗體的純化
            2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白 3A 單克隆抗體的純化
            2.3 非結(jié)構(gòu)蛋白 3A 單克隆抗體的標(biāo)記
            2.4 純化 2C 多抗與 3A 單抗的鑒定
                2.4.1 純化 2C 多抗與 3A 單抗的 SDS-PAGE 檢測(cè)
                2.4.2 酶標(biāo) 3A 單抗效價(jià)的檢測(cè)
                2.4.3 純化后 2C 多抗與酶標(biāo) 3A 單抗蛋白濃度的測(cè)定
            2.5 建立 ELISA 方法流程
            2.6 滴定 2C3AB 抗原的工作濃度
            2.7 滴定 2C 多克隆抗體的工作濃度
            2.8 滴定 3A 單克隆抗體的工作濃度
            2.9 最佳血清稀釋度的確定
            2.10 血清最佳反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度的確定
            2.11 制定 FMDV SPB-ELISA 的標(biāo)準(zhǔn)操作流程
            2.12 陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
        3 結(jié)果
            3.1 純化 2C 多抗的 SDS-PAGE 分析
            3.2 純化 3A 單抗的 SDS-PAGE 分析
            3.3 酶標(biāo) 3A 單抗效價(jià)的檢測(cè)
            3.4 非結(jié)構(gòu)蛋白 2C 多抗、3A 單抗及 2C3AB 蛋白濃度的檢測(cè)
            3.5 非結(jié)構(gòu)蛋白 2C3AB 最佳工作濃度的確定結(jié)果
            3.6 非結(jié)構(gòu)蛋白 2C 多抗最佳工作濃度的確定結(jié)果
            3.7 非結(jié)構(gòu)蛋白 3A 單克隆抗體最佳工作濃度的確定結(jié)果
            3.8 最佳血清稀釋度的確定結(jié)果
            3.9 血清最佳反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度的確定結(jié)果
            3.10 FMDV SPB-ELISA 的操作流程
            3.11 陰、陽(yáng)性血清判定標(biāo)準(zhǔn)（臨界值）的確定結(jié)果
        4 討論
    第三章 3A 單抗阻斷 ELISA 效果的評(píng)價(jià)
        1 材料
            1.1 血清樣品背景
            1.2 相關(guān)試劑盒
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 特異性及敏感性檢測(cè)
            2.2 與 PrioCHECK FMDV-NS ELISA 試劑盒和 FMD 3ABC I-ELISA 試劑盒的符合率對(duì)比
        3 結(jié)果
            3.1 特異性及敏感性判定結(jié)果
            3.2 與 PrioCHECK FMDV-NS ELISA 試劑盒和 FMD 3ABC I-ELISA 試劑盒的符合率對(duì)比
        4 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3155094