發(fā)布時間：2021-04-20 15:21

　　口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）是感染偶蹄類動物的高度傳染性疫病--口蹄疫的病原。其中FMDV內部核糖體進入位點（Internal ribosome entry site，IRES）和2A序列編碼的2A寡肽在FMDV多聚蛋白翻譯起始和裂解成熟過程中發(fā)揮著重要作用。FMDV IRES3’端存在兩個功能性起始密碼子，可分別表達Lab、Lb產物。FMDV優(yōu)先選擇第二個AUG作為起始位點，對于該兩個AUG的選擇機制是近來研究的熱點。2A裂解位點位于2A序列C-端的甘氨酸與脯氨酸之間，而此甘氨酸的使用非常保守，因此該甘氨酸在2A序列中是非常重要的。本研究以FMDV IRES元件3’端兩個功能性起始密碼子周圍序列和2A序列為研究對象，利用生物信息學技術對96條不同血清型的FMDV基因組序列中IRES元件下游兩個具有翻譯起始功能的AUG核苷酸三聯(lián)體所處于的翻譯起始序列環(huán)境和2A序列的密碼子使用模式分別進行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV的兩個AUG所處的核苷酸環(huán)境具有明顯的差異性，并且根據(jù)第一個、第二個AUG環(huán)境分別確定了劣勢、優(yōu)勢翻譯起始序列（-TTTA... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 口蹄疫病毒基因組結構
    1.2 FMDV IRES 元件與 L 蛋白
        1.2.1 IRES 元件
        1.2.2 L 蛋白
    1.3 FMDV 2A 序列結構及功能
    1.4 密碼子偏性
    1.5 本研究的目的和技術路線
第二章 對 FMDV IRES 元件 3’端兩個功能性起始密碼子周圍序列的分析
    2.1 試驗材料
    2.2 序列分析
        2.2.1 由兩個起始密碼子引導的整個編碼序列的密碼子偏性
        2.2.2 GC 含量和靶序列的密碼子偏性的計算
        2.2.3 兩個 AUG 周圍對應環(huán)境的核苷酸偏好的計算
    2.3 分析結果
    2.4 討論
第三章 IRES 引導的不同翻譯起始序列對下游蛋白表達影響的分析
    3.1 重組載體的構建和制備
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 引物設計
        3.1.3 CAT 基因的擴增
        3.1.4 IRES 基因的擴增
        3.1.5 EGFP 基因的擴增
        3.1.6 PCR 產物的回收與純化
        3.1.7 CAT-IRES-EGFP 的融合
        3.1.8 雙酶切
        3.1.9 連接
        3.1.10 轉化
        3.1.11 質粒提取、雙酶切及測序鑒定
        3.1.12 無內毒素質粒的制備
    3.2 重組載體的表達和鑒定
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 細胞轉染
        3.2.3 重組載體表達鑒定
        3.2.4 熒光觀察
        3.2.5 細胞處理
    3.3 WESTERN-BLOTTING 分析
        3.3.1 試驗材料
        3.3.2 聚丙烯凝膠電泳及轉印
        3.3.3 CAT 的檢測
        3.3.4 EGFP 的檢測
        3.3.5 結果分析
    3.4 討論
第四章 對 FMDV 2A 序列密碼子的使用情況分析
    4.1 試驗材料
    4.2 試驗方法
        4.2.1 2A 序列核苷酸使用偏性的計算
        4.2.2 2A 序列連同 2B 序列的第一個密碼子的真實密碼子偏性的計算
        4.2.3 2A 序列密碼子的使用偏性累積的計算
    4.3 試驗結果
        4.3.1 2A 序列的核苷酸使用偏性
        4.3.2 2A 序列各位置的真實密碼子偏性
        4.3.3 2A 序列的密碼子偏性累積
    4.4 討論
第五章 2A 序列 C-端甘氨酸同義密碼子的改變對 2A 裂解效率影響的分析
    5.1 重組載體的構建和制備
        5.1.1 試驗材料
        5.1.2 引物設計
        5.1.3 CAT-2A 的擴增
        5.1.4 EGFP 基因的擴增
        5.1.5 融合 PCR 反應
        5.1.6 雙酶切、連接、轉化
        5.1.7 質粒提取、雙酶切及測序鑒定
        5.1.8 重組載體的制備
    5.2 重組載體的表達、鑒定
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 細胞轉染
        5.2.3 重組載體表達鑒定
        5.2.4 熒光觀察
    5.3 WESTERN-BLOTTING 分析
        5.3.1 試驗材料
        5.3.2 試驗方法
        5.3.3 pCAT-2A-EGFP 系列重組質粒表達的 Western –Blotting 分析結果
    5.4 討論
第六章 全文結論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3149931