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豬圓環(huán)病毒2型Rep蛋白的ATP酶和解旋酶活性的研究

發(fā)布時(shí)間:2021-04-17 14:52
  豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus, PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員,是迄今發(fā)現(xiàn)最小的哺乳動(dòng)物病毒之一。其基因組為單鏈環(huán)狀DNA,大小約為1.76kb,含有兩個(gè)主要的編碼框。主要分為兩種型:豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2). PCV1被認(rèn)為沒(méi)有致病性,而PCV2被證實(shí)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原,同時(shí)也可引起豬皮炎與腎病綜合征、母豬繁殖障礙、仔豬先天性震顫、增生性壞死性腸炎。豬圓環(huán)病毒已在全球各地流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害。目前,對(duì)于豬圓環(huán)病毒引起的相關(guān)疾病還沒(méi)有有效治療方法,只能采取疫苗接種進(jìn)行預(yù)防,且效果不夠理想。只有通過(guò)對(duì)該病毒的復(fù)制機(jī)理及蛋白功能進(jìn)行更加深入的研究,才能找到更好的防治手段。Rep蛋白是一種多功能蛋白,在PCV2病毒復(fù)制的多個(gè)過(guò)程中都起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)Rep蛋白的C端存在解旋酶功能域,而目前為止,對(duì)于Rep蛋白的解旋活性的研究還沒(méi)有開(kāi)展。本研究對(duì)PCV2的Rep蛋白解旋相關(guān)功能開(kāi)展研究,為豬圓環(huán)病毒2型蛋白功能、復(fù)制及致病機(jī)理的研究提供參考。具體工作如下:1.Rep蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)純... 

【文章來(lái)源】:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】:68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】:碩士

【文章目錄】:
目錄
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
一. 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬圓環(huán)病毒概述
    1.2 PCV的病原學(xué)特征
    1.3 PCV的基因組結(jié)構(gòu)
    1.4 PCV基因組的轉(zhuǎn)錄
    1.5 基因組編碼的主要功能蛋白
        1.5.1 Cap蛋白
        1.5.2 Rep蛋白
    1.6 Rep蛋白的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展
    1.7 Rep和Rep'參與的病毒復(fù)制過(guò)程
    1.8 Rep與宿主蛋白的相互作用
    1.9 其他病毒Rep蛋白研究進(jìn)展
        1.9.1 雙粒病毒Rep蛋白研究進(jìn)展
        1.9.2 腺相關(guān)病毒Rep蛋白研究進(jìn)展
二. 研究目的與意義
三. 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 引物設(shè)計(jì)
        3.1.4 熒光底物
        3.1.5 主要培養(yǎng)基及相關(guān)溶液
        3.1.6 緩沖液
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 目的基因的擴(kuò)增
        3.2.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        3.2.3 重組菌的表達(dá)與鑒定
        3.2.4 Rep蛋白的ATPase活性測(cè)定
        3.2.5 SUMO-Rep蛋白非特異性ssDNA及dsDNA結(jié)合活性的檢測(cè)
        3.2.6 SUMO-Rep蛋白的解旋活性測(cè)定
        3.2.7 SUMO-Rep蛋白K180A突變體的活性研究
四. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    4.1 PCV2rep基因的擴(kuò)增
    4.2 重組原核表達(dá)載體pET-28a SUMO-rep的酶切鑒定
    4.3 Rep蛋白原核表達(dá)以及純化條件的摸索
    4.4 Western-blot
    4.5 對(duì)照蛋白SUMO的表達(dá)純化
    4.6 SUMO-REP蛋白ATPase活性研究
        4.6.1 SUMO-Rep蛋白濃度對(duì)ATP水解反應(yīng)的影響
        4.6.2 ATP水解反應(yīng)與時(shí)間的關(guān)系
        4.6.3 二價(jià)金屬離子對(duì)SUMO-Rep ATPase活性的影響
        4.6.4 核酸對(duì)SUMO-Rep ATPase活性的影響
    4.7 SUMO-Rep蛋白的核酸結(jié)合活性研究
        4.7.1 SUMO-Rep與ssDNA結(jié)合活性的檢測(cè)
        4.7.2 SUMO-Rep與3’突出dsDNA及5’突出dsDNA結(jié)合活性的檢測(cè)
    4.8 SUMO-REP蛋白解旋酶活性研究
        4.8.1 SUMO-Rep解旋方向的判定
        4.8.2 解旋反應(yīng)時(shí)間曲線
        4.8.3 蛋白濃度及底物濃度對(duì)解旋速率的影響
        4.8.4 二價(jià)金屬離子對(duì)SUMO-Rep解旋反應(yīng)的影響
        4.8.5 ATP對(duì)解旋反應(yīng)的影響
        4.8.6 溫度對(duì)解旋活性的影響
        4.8.7 捕獲鏈對(duì)解旋反應(yīng)的影響
        4.8.8 解旋酶Km及Vmax的測(cè)定
    4.9 SUMO-Rep ATPase關(guān)鍵活性位點(diǎn)研究
        4.9.1 突變基因的擴(kuò)增
        4.9.2 突變蛋白SUMO-Rep K180A的表達(dá)與純化
        4.9.3 SUMO-RepK180A突變蛋白ATPase活性的檢測(cè)
        4.9.4 SUMO-RepK180A突變蛋白解旋解旋活性的檢測(cè)
五. 討論與結(jié)論
    5.1 討論
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào):3143646

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