豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus, PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員,是迄今發(fā)現(xiàn)最小的哺乳動物病毒之一。其基因組為單鏈環(huán)狀DNA,大小約為1.76kb,含有兩個主要的編碼框。主要分為兩種型：豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）. PCV1被認為沒有致病性,而PCV2被證實是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原,同時也可引起豬皮炎與腎病綜合征、母豬繁殖障礙、仔豬先天性震顫、增生性壞死性腸炎。豬圓環(huán)病毒已在全球各地流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重危害。目前,對于豬圓環(huán)病毒引起的相關疾病還沒有有效治療方法,只能采取疫苗接種進行預防,且效果不夠理想。只有通過對該病毒的復制機理及蛋白功能進行更加深入的研究,才能找到更好的防治手段。Rep蛋白是一種多功能蛋白,在PCV2病毒復制的多個過程中都起著至關重要的作用。通過同源比對發(fā)現(xiàn)Rep蛋白的C端存在解旋酶功能域,而目前為止,對于Rep蛋白的解旋活性的研究還沒有開展。本研究對PCV2的Rep蛋白解旋相關功能開展研究,為豬圓環(huán)病毒2型蛋白功能、復制及致病機理的研究提供參考。具體工作如下：1.Rep蛋白表達質粒的構建及蛋白的表達純... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
Abstract
縮略語表
一. 文獻綜述
    1.1 豬圓環(huán)病毒概述
    1.2 PCV的病原學特征
    1.3 PCV的基因組結構
    1.4 PCV基因組的轉錄
    1.5 基因組編碼的主要功能蛋白
        1.5.1 Cap蛋白
        1.5.2 Rep蛋白
    1.6 Rep蛋白的結構研究進展
    1.7 Rep和Rep'參與的病毒復制過程
    1.8 Rep與宿主蛋白的相互作用
    1.9 其他病毒Rep蛋白研究進展
        1.9.1 雙粒病毒Rep蛋白研究進展
        1.9.2 腺相關病毒Rep蛋白研究進展
二. 研究目的與意義
三. 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 質粒、菌株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 引物設計
        3.1.4 熒光底物
        3.1.5 主要培養(yǎng)基及相關溶液
        3.1.6 緩沖液
    3.2 實驗方法
        3.2.1 目的基因的擴增
        3.2.2 表達質粒的構建與鑒定
        3.2.3 重組菌的表達與鑒定
        3.2.4 Rep蛋白的ATPase活性測定
        3.2.5 SUMO-Rep蛋白非特異性ssDNA及dsDNA結合活性的檢測
        3.2.6 SUMO-Rep蛋白的解旋活性測定
        3.2.7 SUMO-Rep蛋白K180A突變體的活性研究
四. 實驗結果與分析
    4.1 PCV2rep基因的擴增
    4.2 重組原核表達載體pET-28a SUMO-rep的酶切鑒定
    4.3 Rep蛋白原核表達以及純化條件的摸索
    4.4 Western-blot
    4.5 對照蛋白SUMO的表達純化
    4.6 SUMO-REP蛋白ATPase活性研究
        4.6.1 SUMO-Rep蛋白濃度對ATP水解反應的影響
        4.6.2 ATP水解反應與時間的關系
        4.6.3 二價金屬離子對SUMO-Rep ATPase活性的影響
        4.6.4 核酸對SUMO-Rep ATPase活性的影響
    4.7 SUMO-Rep蛋白的核酸結合活性研究
        4.7.1 SUMO-Rep與ssDNA結合活性的檢測
        4.7.2 SUMO-Rep與3’突出dsDNA及5’突出dsDNA結合活性的檢測
    4.8 SUMO-REP蛋白解旋酶活性研究
        4.8.1 SUMO-Rep解旋方向的判定
        4.8.2 解旋反應時間曲線
        4.8.3 蛋白濃度及底物濃度對解旋速率的影響
        4.8.4 二價金屬離子對SUMO-Rep解旋反應的影響
        4.8.5 ATP對解旋反應的影響
        4.8.6 溫度對解旋活性的影響
        4.8.7 捕獲鏈對解旋反應的影響
        4.8.8 解旋酶Km及Vmax的測定
    4.9 SUMO-Rep ATPase關鍵活性位點研究
        4.9.1 突變基因的擴增
        4.9.2 突變蛋白SUMO-Rep K180A的表達與純化
        4.9.3 SUMO-RepK180A突變蛋白ATPase活性的檢測
        4.9.4 SUMO-RepK180A突變蛋白解旋解旋活性的檢測
五. 討論與結論
    5.1 討論
    5.2 結論
參考文獻
致謝



本文編號：3143646