牛冠狀病毒病是世界范圍內(nèi)的重要牛病,其病原牛冠狀病毒（Bovine coronavirus,BCoV）可引起犢牛腹瀉、成年牛冬痢以及呼吸系統(tǒng)疾病,且常與其他病原混合感染,給全球養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展造成了巨大的影響。為防止牛冠狀病毒病的廣泛傳播,我們需要在BCoV感染的初期進(jìn)行診斷并采取相應(yīng)防制措施。目前,可用來檢測牛冠狀病毒病原的方法主要有反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)和ELISA等,其中ELISA試劑盒主要依賴進(jìn)口,成本較高且操作不方便,而反轉(zhuǎn)錄PCR只適用于少量樣品的檢測。為建立操作更方便,檢測成本更低且更適合大規(guī)模檢測病原的方法,本研究擬利用BCoV N基因進(jìn)行表達(dá)純化,并構(gòu)建BCoV N蛋白噬菌體單鏈抗體庫,以期獲得結(jié)合活性較高的特異性單鏈抗體,為BCoV新型快速檢測試劑的研發(fā)奠定前期基礎(chǔ)。本研究內(nèi)容及結(jié)果包括:1.BCoV N蛋白的原核表達(dá)及小鼠免疫本試驗(yàn)將已構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pET28a-N轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中,成功表達(dá)出目的蛋白,經(jīng)Western blot鑒定正確后分析蛋白可溶性并進(jìn)行純化。結(jié)果顯示重組蛋白條帶大小約54 kDa,為可溶性表達(dá),其可被His單克隆抗體特異性識別,純化后的... 

【文章來源】：河北科技師范學(xué)院河北省

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

M13噬菌體結(jié)構(gòu)圖[65]

第二章BCoVN蛋白的表達(dá)與純化202.3結(jié)果2.3.1重組BCoVN蛋白的表達(dá)鑒定1.重組N蛋白的表達(dá)鑒定將pET28a-N-BL2菌株用1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)8h后，獲得重組蛋白，通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行驗(yàn)證（圖2-1）。結(jié)果顯示與pET-28a-BL21對照相比，pET28a-N-BL21在54kDa附近有明顯的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期大小一致。取誘導(dǎo)后的菌液，以1:1000稀釋的鼠源抗His標(biāo)簽單克隆抗體為一抗，1:5000稀釋的山羊抗小鼠HRP-IgG作為二抗，經(jīng)由Western-blot鑒定，結(jié)果如圖2-2，在54kDa處可觀察到明顯的目的條帶，而對照在54kDa處則無條帶，表明該重組蛋白可被抗His標(biāo)簽單抗特異性的識別，重組N蛋白能良好的表達(dá)。70kDkDM12544055圖2-1His-N蛋白的表達(dá)分析Fig.2-1AnalysisofprokaryoticexpressionofHis-NproteinM：ProteinMarker;1.空載對照;2.重組蛋白12WB:α-His圖2-2Westernblot分析His-N蛋白的表達(dá)Fig.2-2WesternblotanalysisofHis-Nproteinexpression1.空載對照;2.重組His-N蛋白

第二章BCoVN蛋白的表達(dá)與純化202.3結(jié)果2.3.1重組BCoVN蛋白的表達(dá)鑒定1.重組N蛋白的表達(dá)鑒定將pET28a-N-BL2菌株用1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)8h后，獲得重組蛋白，通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行驗(yàn)證（圖2-1）。結(jié)果顯示與pET-28a-BL21對照相比，pET28a-N-BL21在54kDa附近有明顯的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期大小一致。取誘導(dǎo)后的菌液，以1:1000稀釋的鼠源抗His標(biāo)簽單克隆抗體為一抗，1:5000稀釋的山羊抗小鼠HRP-IgG作為二抗，經(jīng)由Western-blot鑒定，結(jié)果如圖2-2，在54kDa處可觀察到明顯的目的條帶，而對照在54kDa處則無條帶，表明該重組蛋白可被抗His標(biāo)簽單抗特異性的識別，重組N蛋白能良好的表達(dá)。70kDkDM12544055圖2-1His-N蛋白的表達(dá)分析Fig.2-1AnalysisofprokaryoticexpressionofHis-NproteinM：ProteinMarker;1.空載對照;2.重組蛋白12WB:α-His圖2-2Westernblot分析His-N蛋白的表達(dá)Fig.2-2WesternblotanalysisofHis-Nproteinexpression1.空載對照;2.重組His-N蛋白

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]抗犬細(xì)小病毒VP2蛋白單鏈抗體的制備與中和活性研究[J]. 李彤彤,宋彩玲,楊凱越,王文靜,陳慧宇,劉明.  中國生物工程雜志. 2020(04)
[2]噬菌體展示系統(tǒng)篩選糖尿病相關(guān)抗原蛋白及應(yīng)用效果評價(jià)[J]. 劉堯,林駿,梁永羿,山云,王洪濤,徐良.  中國醫(yī)藥生物技術(shù). 2019(06)
[3]檢測牛冠狀病毒抗體間接ELISA方法的建立與應(yīng)用[J]. 胡林杰,孟野,周玉龍,賈偉強(qiáng),翟海瑞,武瑞,侯喜林.  微生物學(xué)通報(bào). 2020(01)
[4]噬菌體抗體庫技術(shù)篩選抗VEGF165單克隆抗體[J]. 詹明碩,劉方杰,張亞蘭.  生物技術(shù)通訊. 2019(03)
[5]牛冠狀病毒RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 何琪富,郭紫晶,李然,周軍,岳華,張斌,湯承.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(10)
[6]鼠源噬菌體抗體展示庫的構(gòu)建及初步應(yīng)用[J]. 徐重新,張霄,張存政,劉媛,仲建鋒,董颯,胡曉丹,林曼曼,劉賢金.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2017(01)
[7]人源抗EV71病毒中和表位SP70的Fab抗體研制[J]. 余艷瓊,翁育偉,嚴(yán)延生.  中國人獸共患病學(xué)報(bào). 2016(08)
[8]人源抗H7N9血凝素中和抗體IgG的制備及鑒定[J]. 陳雅,熊四平,唐奇,王怡雯,耿以如,顧慧,徐亞如,周熒,仇鎮(zhèn)寧,馮振卿,朱進(jìn).  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2016(07)
[9]天山牦牛病毒性腹瀉等傳染病的血清學(xué)監(jiān)測與調(diào)查[J]. 石琴,袁立崗,蒲敬偉,李靜,徐晶晶,沙麗,楊曉丹,劉海東.  畜牧與獸醫(yī). 2015(06)
[10]BVDV、BCV和BRV三重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 林初文,沈志強(qiáng).  畜牧與獸醫(yī). 2013(07)

博士論文
[1]人源性抗?jié)h灘病毒中和活性抗體的制備和鑒定[D]. 李卓.第四軍醫(yī)大學(xué) 2017

碩士論文
[1]駝源天然噬菌體納米抗體展示庫的構(gòu)建和鑒定及抗GDH納米抗體的篩選[D]. 方媛.寧夏醫(yī)科大學(xué) 2019
[2]豬流行性腹瀉病毒S蛋白特異性單域抗體的制備及鑒定[D]. 王莉鑫.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[3]犢牛冠狀病毒和輪狀病毒間接ELISA診斷方法的建立與初步應(yīng)用[D]. 陸亞冬.石河子大學(xué) 2018
[4]噬菌體天然抗體庫淘選及篩選方法的優(yōu)化[D]. 蔣紅欣.上海交通大學(xué) 2018
[5]豬流行性腹瀉病毒S蛋白的表達(dá)及其特異性單域抗體的制備[D]. 趙鑫鑫.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[6]豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建與篩選[D]. 張秋麗.鄭州大學(xué) 2017
[7]豬源噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及抗rSpaA單鏈抗體的篩選[D]. 王銳.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016



本文編號：3139801