解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是多種重要飼用酶制劑的生產(chǎn)菌株,因其具有較強(qiáng)的蛋白分泌能力,其在作為高效表達(dá)宿主菌方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景。然而,解淀粉芽孢桿菌中存在的限制修飾系統(tǒng)、質(zhì)粒穩(wěn)定性差、表達(dá)元件缺乏以及內(nèi)源蛋白酶活力高等問題嚴(yán)重限制了其在基因工程研究中的廣泛應(yīng)用。本研究的核心材料解淀粉芽孢桿菌K11（B.amyloliquefaciens K11）是一株高產(chǎn)中性蛋白酶和角蛋白酶的菌株。前期通過轉(zhuǎn)化條件的摸索和質(zhì)粒結(jié)構(gòu)元件的優(yōu)化,已較好的解決了 K11菌株遺傳和質(zhì)粒穩(wěn)定性差的難題,為將K11菌株開發(fā)成為高效的異源蛋白表達(dá)宿主奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究以解淀粉芽孢桿菌K1 1為宿主菌、克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因BcaprE作為報告基因,通過高產(chǎn)酶蛋白的工業(yè)菌株的強(qiáng)啟動子（PamyQ、PaprE、Pnpr）和高效分泌信號肽（SPamyQ、SPaprE、SPnpr）的優(yōu)化組合,篩選適用于K11菌株高效分泌表達(dá)外源蛋白的通用表達(dá)元件。搖瓶測試結(jié)果顯示:在以α-淀粉酶基因啟動子PamyQ、堿性蛋白酶基因信號肽SPaprE組成的表達(dá)元件調(diào)控下,... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：94 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

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ＱＱ－Ｅ，?ＮＮ－Ｅ，?ＣＱ－Ｅ，?ＣＮ－Ｅ，ＱＣ－Ｅ，ＱＮ－Ｅ，ＮＣ－Ｅ?和?ＮＱ－Ｅ。??將這９株重組菌在同一發(fā)酵條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，７２?ｈ后測定上清液中的堿性蛋??白酶活性。從圖２．４ａ可以看出，９個表達(dá)元件均能介導(dǎo)堿性蛋白酶基因在解??淀粉芽孢桿菌Ｋ１１中的重組表達(dá)，重組表達(dá)水平分別是對照菌株Ｋ１１－Ｃ的１．１７－１６．６３??倍。其中，由尸ａｍｊ；２－ＳＰａｐｒＥ介導(dǎo)的ＱＣ－Ｅ菌株的堿性蛋白酶的分泌水平最高，為１３８０４??Ｕ／ｍＬ；?Ｐｆｌ嚴(yán)五－ＳＰａｍｙＱ介導(dǎo)的的菌株ＣＱ－Ｅ的產(chǎn)酶水平次之，為１１０９１?Ｕ／ｍＬ。菌株??ＱＣ－Ｅ和ＣＱ－Ｅ所分泌的胞外ＢｃａｐｒＥ的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他表達(dá)元件所介導(dǎo)的產(chǎn)酶水平??（９７３－６１１９?Ｕ／ｍＬ）。??ａ?ｂ??２?ＩＳＯＷ?ｋＤａ?Ｍ?Ｉ?２?３?４?５?６?７?８?９?ｉ〇??ｆ?ｎｏｆｉｏ?－?ｌ０？??ｉ６０００?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??ｊ?Ｉ?Ｌｉｌｉｉｌ－?，５廣??，＂纖（卿ｌ°“卜?，??圖２．４不同表達(dá)元件介導(dǎo)的重組堿性蛋白酶ＳｃａｐｒＥ搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶情況??Ｆｉｇ?２．４?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ａｌｋａｌｉｎｅ?ｐｒｏｔｅａｓｅ?ＢｃａｐｖＥ?ｉｎ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｂ．?ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ??ｓｔｒａｉｎｓ?ｏｎ?ｓｈａｋｅ?ｆｌａｓｋ?ｌｅｖｅｌ??將９株重組菌和對照菌株ＩＣｌｌ－Ｃ的發(fā)酵上清液進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳分析。據(jù)??Ｖｅｃｔｏｒ軟件分析，堿性蛋白酶ＢｃａｐｒＥ成熟蛋白的大小應(yīng)為２６．８?ｋＤａ。從圖２．４ｂ可以??看出

進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，７２?ｈ后分別測定發(fā)酵上清液液中的生麥芽糖淀粉酶活性或中性蛋白酶??活性。??從圖２．５可以看出，發(fā)酵７２?ｈ后，重組菌ＱＣ－Ｍ發(fā)酵上清液中的生麥芽糖淀粉??酶活力可達(dá)１９?Ｕ／ｍＬ，而對照菌株Ｋ１１－Ｃ中則未檢測到任何的生麥芽糖淀粉酶活性，??說明生麥芽糖淀粉酶基因Ｇｓ－Ｍ／ｌｃｗｅ在Ｐａｍ＿ｙ０－ＳＰａｐｒＥ表達(dá)兀件的介導(dǎo)下，成功實(shí)現(xiàn)??了在解淀粉芽孢桿菌Ｋ１１中的分泌表達(dá)。??８?２？．?ｂ?ｋＤａ?Ｍ??卜．?Ｉ?Ｍｌ??■如．二二，??■??７?〇?——?一＾—＇?＿?ｄ，??ＫＩｌ－Ｃ?ＱＣ－Ｍ??圖２．５重組生麥芽糖淀粉酶在解淀粉芽孢桿菌ＩＣ１１中的產(chǎn)酶情況??Ｆｉｇ．?２．５?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ?ａ－ａｍｙｌａｓｅ?Ｇ＾－ＭＡａｓｅ?ｉｎ?Ｂ．?ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ?Ｋ１１??ｏｎ?ｓｈａｋｅ?ｆｌａｓｋ?ｌｅｖｅｌ．??３９??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3136733