維甲酸誘導(dǎo)基因I型（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）是最近幾年才發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體，是機(jī)體先天性免疫的重要組成部分。在病毒感染機(jī)體、在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖時，RIG-I能特異性地識別并結(jié)合這一過程中所產(chǎn)生的RNA，改變自身構(gòu)象，與下游接頭分子結(jié)合，開啟信號通路，最終使機(jī)體發(fā)揮先天性免疫作用。RIG-I在進(jìn)化中是保守的，雞基因組內(nèi)沒有RIG-I基因，鴨和鵝則具有完整的RIG-I基因。新城疫和禽流感每次爆發(fā)都造成雞的大面積感染，RIG-I可以識別并結(jié)合這兩種病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時產(chǎn)生的RNA，這兩者中是否存在聯(lián)系，引起了很多研究人員的興趣。本試驗(yàn)利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)鵝源RIG-I基因的雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1）系，為后續(xù)的試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要內(nèi)容和結(jié)果如下：1.穩(wěn)定表達(dá)鵝源RIG-I的雞胚成纖維細(xì)胞的構(gòu)建根據(jù)GenBank上的RIG-I序列，結(jié)合PiggyBac-513B-1載體序列設(shè)計(jì)出引物，以質(zhì)粒Flag-RIG-I為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)酶切后將RIG-I與載體PiggyBac-513B-1相連，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后... 

【文章來源】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉林省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文章綜述
    1.1 RIG-I 簡介
        1.1.1 RIG-I 概述
        1.1.2 RIG-I 的結(jié)構(gòu)
    1.2 RIG-I 介導(dǎo)的信號通路
    1.3 禽 RIG-I 樣受體研究進(jìn)展
        1.3.1 禽 RIG-I 研究進(jìn)展
        1.3.2 禽 MDA5 概述
        1.3.3 禽 LGP-2 概述
    1.4 PiggyBac 簡介
        1.4.1 轉(zhuǎn)座子概述
        1.4.2 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子概述
    1.5 本研究的目的與意義
第二章 研究內(nèi)容
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物、所用載體和細(xì)胞株
        2.1.2 試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)中所用溶液的配制
    2.2 方法
        2.2.1 常用試驗(yàn)技術(shù)及試劑盒的使用方法
        2.2.2 引物的設(shè)計(jì)
        2.2.3 鵝源 RIG-I 基因全長及 CARD 區(qū)域的 PCR 擴(kuò)增
        2.2.4 原核表達(dá)載體 pET-32a-CARD 的構(gòu)建及鑒定
        2.2.5 PiggyBac-RIG-I 載體的構(gòu)建及鑒定
        2.2.6 鵝源 RIG-I CARD 區(qū)域多克隆抗血清的制備
        2.2.7 RT-PCR 鑒定引物的特異性驗(yàn)證
        2.2.8 雞胚成纖維細(xì)胞的制備
        2.2.9 DF-1 細(xì)胞對嘌呤霉素的敏感性實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)鵝源 RIG-I 的雞胚成纖維細(xì)胞系
        2.2.11 細(xì)胞系穩(wěn)定傳代的鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 鵝源 RIG-I 全基因的 PCR 擴(kuò)增
        2.3.2 鵝源 RIG-I 基因 CARD 區(qū)域的 PCR 擴(kuò)增
        2.3.3 pET-32A-CARD 載體的 PCR 鑒定
        2.3.4 PiggyBac-513B-1-RIG-I 載體的 PCR 鑒定
        2.3.5 鵝源 RIG-I CARD 區(qū)域多克隆抗血清的制備
        2.3.6 RT-PCR 鑒定引物特異性驗(yàn)證
        2.3.7 DF-1 細(xì)胞對嘌呤霉素的敏感性實(shí)驗(yàn)
        2.3.8 轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒濃度測定
        2.3.9 細(xì)胞系鑒定
    2.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]病毒感染引發(fā)天然免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展[J]. 孫文香,蔣爭凡.  中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報. 2013(05)
[2]Generation of a human embryonic stem cell line stably expressing high levels of the fluorescent protein mCherry[J]. Dmitry A Ovchinnikov,Jennifer P Turner,Drew M Titmarsh,Nilay Y Thakar,Dong Choon Sin,Justin J Cooper-White,Ernst J Wolvetang.  World Journal of Stem Cells. 2012(07)
[3]利用piggyBac載體制備小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[J]. 張金噸,趙麗霞,吳寶江,李云霞,張靜南,蘇杰,孫偉,戴雁峰,郭繼彤,胡樹香,李瑤,汪瑋,劉鵬濤,李喜和.  中國科學(xué):生命科學(xué). 2012(07)
[4]二化螟piggyBac類轉(zhuǎn)座子的克隆與分析[J]. 羅光華,吳敏,韓召軍,李曉歡,錢路,方繼朝.  昆蟲學(xué)報. 2012(07)
[5]抗病毒感染固有免疫應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J]. 謝廣成,段招軍.  病毒學(xué)報. 2012(03)
[6]鵝模式受體MDA5基因克隆及功能分析[J]. 丁娜,孫英杰,張石磊,仇旭升,譚磊,丁鏟.  中國動物傳染病學(xué)報. 2012(03)
[7]禽Toll樣受體研究進(jìn)展[J]. 丁娜,孫英杰,丁鏟.  中國動物傳染病學(xué)報. 2011(06)
[8]反向PCR鑒定piggyBac介導(dǎo)的哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因研究[J]. 郝碧芳,王猛.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(10)
[9]轉(zhuǎn)座子在動物轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用[J]. 謝維欣,武建明,王洪梅,高運(yùn)東,仲躋峰,何洪彬.  家畜生態(tài)學(xué)報. 2011(05)
[10]視黃酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ樣受體與抗病毒固有免疫的研究進(jìn)展[J]. 陳思源,楊毅,王衛(wèi)平.  中國免疫學(xué)雜志. 2011(07)

碩士論文
[1]細(xì)胞PKR-eIF2α抗新城疫病毒作用研究[D]. 張石磊.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2013
[2]穩(wěn)定表達(dá)新城疫病毒V蛋白DF-1細(xì)胞系的建立[D]. 唐文雅.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2012



本文編號：3133666