重組細(xì)菌載體疫苗,尤其是重組減毒沙門氏菌疫苗（Recombinant Attenuated Salmonella Vaccine,RASV）,因其可以有效地激發(fā)宿主產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)、體液免疫反應(yīng)以及細(xì)胞免疫反應(yīng)的特點(diǎn),已經(jīng)被廣泛用作遞送保護(hù)性抗原和核酸疫苗的載體。RASV是具有構(gòu)完整細(xì)菌結(jié)構(gòu)的活疫苗,因此重組疫苗攜帶的外源性抗原或真核表達(dá)質(zhì)粒難以從細(xì)菌中釋放出來而發(fā)揮作用,而在體內(nèi)殘留的沙門氏菌也會造成生物污染。為解決上述問題,本研究基于細(xì)菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)（TypeⅥSecretion System,T6SS）分泌的肽聚糖水解蛋白,設(shè)計(jì)了一系列由體內(nèi)誘導(dǎo)啟動子調(diào)控的裂解組合,并最終篩選出了一組由Mg²⁺調(diào)控的體內(nèi)裂解系統(tǒng)去遞送外源抗原。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的Ⅵ型分泌系統(tǒng)能夠分泌兩種肽聚糖水解因子Tse1和Tse3,這兩種蛋白能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)造成細(xì)菌裂解死亡。本研究首先選用了三種內(nèi)源性表達(dá)啟動子,分別是限Mg2+調(diào)控啟動子PpagC、限Fe2+調(diào)控啟動子P_{viu B}以及組成型表達(dá)啟動子araC P

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Fe2+調(diào)控的裂解系統(tǒng)[31]

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文18圖3-1調(diào)控裂解質(zhì)粒的構(gòu)建模型圖Fig.3-1Diagramofmodelillustratingtheconstructionforregulatedlysisplasmids（1）細(xì)菌基因組的抽提為了獲取啟動子PpagC（來源于S.Typhimurium），啟動子PviuB（來源于V.cholerae），裂解基因tse1和tse3（來源于P.aeruginosa），需要提取相應(yīng)菌株的基因組以作為擴(kuò)增模板。分別將UK-1菌株、V.choleraeO1菌株、P.aeruginosaPAO1菌株接種劃線到固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，次日，挑選平板上的單菌落分別接種于5mL液體LB中過夜37℃振蕩培養(yǎng)；第二日，各吸取1mL菌液，按照細(xì)菌基因組抽提試劑盒（天根，目錄DP302）的說明書進(jìn)行基因組的抽提，抽提完的基因組經(jīng)核酸蛋白測定儀（NanoDrop2000，ThermoScientific）測定濃度后保存于-20℃。（2）細(xì)菌質(zhì)粒的提取為了獲取信號肽序列SS1（blass）和SS2（pelBss），以及表達(dá)載體，需要從相應(yīng)宿主菌中提取質(zhì)粒以作為擴(kuò)增模板。將保存pYA4088質(zhì)粒的χ9241菌株接種至LB固體培養(yǎng)基復(fù)蘇，保存pYA4518質(zhì)粒的χ7232菌株接種至LB（Cm+）固體培養(yǎng)基復(fù)蘇，保存pSW220質(zhì)粒的χ6097菌株接種至LB（Cm+）固體培養(yǎng)基復(fù)蘇；次日挑取各培養(yǎng)基上的單菌落分別在液體LB（Cm+或無Cm+）的培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，分別取1mL菌液，按照質(zhì)粒小提試劑盒（天根，目錄DP103）的說明書進(jìn)行操作。（3）目的片段的擴(kuò)增PCR所需的引物、模板以及擴(kuò)增產(chǎn)物見表3-6，PCR反應(yīng)體系見表3-7，PCR反應(yīng)條件見3-8。表3-6PCR所需引物、模板及PCR產(chǎn)物

第3章調(diào)控裂解組合的構(gòu)建、表達(dá)與篩選253.3結(jié)果與分析3.3.1裂解質(zhì)粒的構(gòu)建（1）為了獲得所需的各個基因片段，首先使用PCR的方法將啟動子PpagC和PviuB，信號肽序列SS1和SS2，裂解基因tse1和tse3以及載體片段V1和V2從相應(yīng)的模板中擴(kuò)增出來，其中V2載體中帶有Ptrc序列。經(jīng)電泳鑒定，各個PCR產(chǎn)物大小均符合預(yù)期。其中SS1有6個片段SS1-1~SS6-1，SS2有6個片段SS2-1~SS2-6，PpagC有2個片段PpagC-1和PpagC-2，PviuB有兩個片段PviuB-1和PviuB-2，各個重復(fù)片段之間除了用于融合PCR的接口序列不同外，其他序列均一致。目的片段PCR鑒定結(jié)果見圖3-2。圖3-2目的片段的PCR擴(kuò)增Fig.3-2PCRproductsoftargetedfragments.(A)M:DNAMarker;1~6:SS2-1~SS2-6;7~12:SS1-6~SS1-6(B)M:DNAMarker;1:PpagC-1;2:PpagC-2;3:PviuB-1;4:PviuB-2;5:tse1-1;6:tse1-2;7:tse3-1;8:tse3-2;9:V1;10:V2（2）獲得純化的目的片段序列之后，按照本章介紹的方法進(jìn)行PCR片段的融合。首先進(jìn)行兩個片段之間的融合，即將SS1/SS2和tse1/tse3片段進(jìn)行融合，分別獲得融合片段SS1-tse1-1~SS1-tse1-3、SS1-tse3-1~SS1-tse3-3、SS2-tse1-1~SS2-

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]裂解系統(tǒng)在細(xì)菌載體疫苗中的應(yīng)用[J]. 唐一波,劉青,李沛,羅紅艷,孔慶科.  生物工程學(xué)報. 2019(03)



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