布魯氏菌病是一種重要的人畜共患病，其病原布魯氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，感染后，主要引起動(dòng)物流產(chǎn)和人的波狀熱。布魯氏菌無(wú)經(jīng)典的毒力因子，如質(zhì)粒，外毒素，溶細(xì)胞素，莢膜或內(nèi)毒素特性的脂多糖分子，其毒力主要體現(xiàn)在入侵宿主細(xì)胞并在胞內(nèi)存活的能力，基于此，布魯氏菌能感染宿主建立慢性感染，較難被清除，因此研究布魯氏菌建立慢性感染和胞內(nèi)存活所需的基因?qū)τ陉U明布魯氏菌的致病機(jī)制具有重要意義。本研究主要采用信號(hào)標(biāo)簽轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)和基因芯片技術(shù)分別篩選鑒定布魯氏菌建立慢性感染和胞內(nèi)存活所需基因，為研究布魯氏菌致病機(jī)制提供理論研究資料。本研究中，我們通過逐步施壓的方法，誘導(dǎo)流產(chǎn)布魯氏菌S2308產(chǎn)生萘啶酸抗性（Nal）作為篩選標(biāo)記，以抗性菌株為親本，構(gòu)建含8個(gè)信號(hào)標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫(kù)，共含有突變株3759株，以BABL/c小鼠為動(dòng)物模型，共篩選2048株突變株，獲得89株減毒株。通過步移PCR鑒定了24株減毒株的插入失活基因，其中獲得一株粗糙型布魯氏菌，鑒定為rfbE基因失活，rfbE基因?yàn)椴剪斒暇鶲-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白，為進(jìn)一步研究該基因的功能，我們通過定向缺失技術(shù)構(gòu)建流產(chǎn)布魯氏... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博上學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)簽名表
摘要
Abstract
圖表清單
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 布魯氏菌研究概況
        1.1.1 概況
        1.1.2 分類
        1.1.3 傳播途徑
    1.2 布魯氏菌主要毒力基因研究進(jìn)展
        1.2.1 脂多糖（LPS）
        1.2.2 四型分泌系統(tǒng)（T4SS）
        1.2.3 雙組份調(diào)控系統(tǒng)（BvrR/BvrS）
        1.2.4 環(huán)β-1,2-葡聚糖
        1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）
        1.2.6 過氧化氫酶
        1.2.7 其他毒力因子
    1.3 細(xì)菌毒力基因篩選方法
        1.3.1 生物信息學(xué)方法
        1.3.2 基因芯片技術(shù)
        1.3.3 轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)
        1.3.4 體內(nèi)誘導(dǎo)技術(shù)
        1.3.5 差異熒光誘導(dǎo)
        1.3.6 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)
        1.3.7 轉(zhuǎn)錄序列選擇性捕獲技術(shù)
        1.3.8 其他篩選方法
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 信號(hào)標(biāo)簽隨機(jī)突變庫(kù)篩選布魯氏菌減毒突變株
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌株與試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器
        2.1.4 溶液配制
        2.1.5 流產(chǎn)布魯氏菌萘啶酸抗性菌株的篩選及毒力鑒定
        2.1.6 標(biāo)簽質(zhì)粒 pUTmini-Tn5-Tag 的構(gòu)建
        2.1.7 PCR 依賴的信號(hào)標(biāo)簽的交叉反應(yīng)性
        2.1.8 信號(hào)標(biāo)簽隨機(jī)突變庫(kù)的構(gòu)建
        2.1.9 減毒突變株的篩選
        2.1.10 減毒突變株插入失活基因鑒定
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 流產(chǎn)布魯氏菌誘導(dǎo)產(chǎn)生 Nal 抗性并保持原菌株對(duì)小鼠的毒力
        2.2.2 成功構(gòu)建 8 個(gè)標(biāo)簽轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒且 PCR 交叉反應(yīng)為陰性
        2.2.3 標(biāo)簽突變庫(kù)的構(gòu)建
        2.2.4 減毒突變株的篩選
        2.2.5 減毒突變株的失活基因鑒定
    2.3 討論
第三章 流產(chǎn)布魯氏菌 rfbE 缺失株的構(gòu)建及致病性分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株、細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 試劑
        3.1.3 儀器
        3.1.4 溶液配制
        3.1.5 自殺性質(zhì)粒和互補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.1.6 缺失株和互補(bǔ)株的構(gòu)建
        3.1.7 細(xì)菌表型鑒定
        3.1.8 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        3.1.9 粘附入侵和胞內(nèi)存活試驗(yàn)
        3.1.10 間接免疫熒光試驗(yàn)
        3.1.11 細(xì)胞死亡鑒定
        3.1.12 對(duì)小鼠致病性分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
        3.2.2 缺失株和互補(bǔ)株構(gòu)建結(jié)果
        3.2.3 細(xì)菌表型鑒定結(jié)果
        3.2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果
        3.2.5 粘附入侵結(jié)果
        3.2.6 細(xì)胞胞內(nèi)存活結(jié)果
        3.2.7 細(xì)胞壞死鑒定
        3.2.8 小鼠致病性分析結(jié)果
    3.3 討論
第四章 布魯氏菌 rfbE 缺失株酸休克蛋白上調(diào)機(jī)制及功能
    4.1 材料和方法
        4.1.1 菌株
        4.1.2 細(xì)胞
        4.1.3 試劑
        4.1.4 主要儀器
        4.1.5 溶液配制
        4.1.6 細(xì)菌 RNA 提取
        4.1.7 基因芯片分析及 qRT-PCR 驗(yàn)證
        4.1.8 質(zhì)粒構(gòu)建
        4.1.9 Asp24 蛋白表達(dá)
        4.1.10 Asp24 兔抗血清的制備
        4.1.11 布魯氏菌突變株衍生株的構(gòu)建
        4.1.12 細(xì)菌組分提取及免疫印跡試驗(yàn)
        4.1.13 細(xì)菌粘附入侵以及胞內(nèi)存活測(cè)定方法
        4.1.14 細(xì)胞毒力及死亡類型鑒定
        4.1.15 細(xì)菌酸性誘導(dǎo)及耐酸性試驗(yàn)
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 Asp24 蛋白在 rfbE 缺失株中出現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)
        4.2.2 Asp24 蛋白上調(diào)表達(dá)與 O-抗原在 rfbE 缺失株中胞內(nèi)合成和積累有關(guān)
        4.2.3 Asp24 蛋白上調(diào)表達(dá)不是 rfbE 缺失株導(dǎo)致巨噬細(xì)胞腫脹和壞死的原因
        4.2.4 Asp24 蛋白在酸性條件下被誘導(dǎo)表達(dá)但與細(xì)菌酸性抵抗力無(wú)關(guān)
        4.2.5 改變 Asp24 蛋白表達(dá)量影響布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活
    4.3 討論
第五章 基因芯片篩選流產(chǎn)布魯氏菌胞內(nèi)存活相關(guān)基因
    5.1 材料與方法
        5.1.1 菌種
        5.1.2 細(xì)胞
        5.1.3 試劑
        5.1.4 儀器
        5.1.5 溶液配制
        5.1.6 細(xì)菌收集
        5.1.7 細(xì)菌總 RNA 提取
        5.1.8 標(biāo)記和純化 RNA
        5.1.9 雜交
        3.1.10 芯片洗滌與掃描
        5.1.11 數(shù)據(jù)處理和分析
        5.1.12 qRT-PCR 驗(yàn)證芯片結(jié)果
        5.1.13 主要差異表達(dá)基因功能分類
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 RNA 質(zhì)量分析
        5.2.2 確定差異表達(dá)基因
        5.2.3 差異基因熱圖和聚類分析
        5.2.4 差異基因參與的代謝通路分析
        5.2.5 qRT-PCR 的驗(yàn)證和主要差異表達(dá)基因的功能分類
    5.3 討論
第六章 流產(chǎn)布魯氏菌 ddp 基因缺失株的構(gòu)建及致病性分析
    6.1 材料與方法
        6.1.1 菌株與細(xì)胞系
        6.1.2 試劑
        6.1.3 儀器
        6.1.4 溶液配制
        6.1.5 自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.1.6 缺失株構(gòu)建
        6.1.7 細(xì)菌表型鑒定
        6.1.8 細(xì)菌 LPS 提取與免疫印跡鑒定
        6.1.9 ddp 缺失株粘附入侵試驗(yàn)
        6.1.10 ddp 缺失巨噬細(xì)胞內(nèi)存活試驗(yàn)
        6.1.11 ddp 缺失株細(xì)胞毒性試驗(yàn)
        6.1.12 ddp 缺失株感染巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定
        6.1.13 ddp 缺失株對(duì)小鼠致病性分析
    6.2 結(jié)果
        6.2.1 ddp 基因生物信息學(xué)分析
        6.2.2 缺失株的構(gòu)建結(jié)果
        6.2.3 細(xì)菌表型分析結(jié)果
        6.2.4 免疫印跡鑒定細(xì)菌 LPS 結(jié)果
        6.2.5 細(xì)菌粘附入侵結(jié)果
        6.2.6 細(xì)菌胞內(nèi)存活結(jié)果
        6.2.7 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果
        6.2.8 ddp 缺失株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平分析
        6.2.9 ddp 缺失株對(duì)小鼠的致病性分析結(jié)果
    6.3 討論
第七章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞中Th1/Th2型細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 單雪芹,韓先干,張敏,宋軍,劉海文,田明星,潘玲,丁鏟,周錦萍,于圣青.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2013(04)
[2]運(yùn)用體內(nèi)表達(dá)技術(shù)篩選霍亂弧菌感染成年小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因[J]. 陳建東,張競(jìng),闞飆,鐘增濤,朱軍.  南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2010(01)
[3]肺炎鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因的篩選及初步鑒定[J]. 孟江萍,尹一兵,張雪梅,黃遠(yuǎn)帥,藍(lán)鍇.  微生物學(xué)報(bào). 2006(04)
[4]高通量藥物靶位基因篩選的策略與方法[J]. 徐偉文,李文全.  中國(guó)藥學(xué)雜志. 2002(04)



本文編號(hào)：3129053