發(fā)布時間：2021-04-08 04:47

　　豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type2, PCV2）基因組為單鏈環(huán)狀DNA,包含兩個主要開放閱讀框。ORF1編碼2個與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白（Rep和Rep’）,Rep由全長ORF1編碼314個氨基酸（aa）組成,Rep’由ORF1轉(zhuǎn)錄剪接內(nèi)含子而來,由178個aa組成。Rep與Rep’蛋白形成的復(fù)合體是病毒復(fù)制所必需的,在宿主細胞酶類分子的參與下,該病毒復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制機制（Rolling-circle replication, RCR）完成的。由于PCV2基因組較小,編碼蛋白數(shù)量有限,據(jù)此推測病毒復(fù)制需要宿主細胞酶類分子的參與,究竟宿主細胞哪類蛋白參與其中所知甚少。本研究通過酵母單雜交技術(shù)篩選宿主細胞中與PCV2復(fù)制相關(guān)的蛋白,從病毒宿主細胞-豬腎細胞株（PK-15）中初步鑒定出有4種蛋白與PCV2基因組莖環(huán)序列發(fā)生互作,這4種蛋白分別為配體相關(guān)蛋白復(fù)合體（AP2α2）、ETS相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（Elf4）、鐵硫束組裝酶（ISCU）蛋白和肌動蛋白（p-actin）;進一步通過蛋白過表達及RNAi技術(shù)驗證這些蛋白對PCV2病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)作用。第一、與PCV2基因組莖環(huán)... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

RCR溶爐模型(A);PCV的復(fù)制模型(B)

重組載體pAbAi-SL54雙酶切和凝膠電泳表明，從重組質(zhì)粒上切下了與蓮環(huán)結(jié)構(gòu)序列長度一致的片段（60 bp)(圖2.1),表明目的順式元件序列已成功與pAbAi載體連接。將酶切片段長度正確的重組質(zhì)粒送測序鑒定，插入序列與基環(huán)寡聚核若酸序列完全一致且方向正確，將誘館載體命名為 pAbAi-SL54。2. 2. 2誘館酵母菌株AbA的最低使用濃度的確定菌落PCR鑒定結(jié)果（圖2.2)表明獲得了長度約為1.4 kb的目的片段，證明線性化的pAbAi-SL54株誘餅載體已整合到酵母YlHGold基因組中，成功獲得了誘謂酵母菌株。將誘館酵母涂布在含不同濃度AbA的SDAUra固體培養(yǎng)基上，當(dāng)AbA濃度達到200ng/mL時，仍不能完全抑制酵母菌的生長，因此繼續(xù)提高AbA濃度，當(dāng)AbA的濃度提高到1000 ng/mL時

3.2.1目的基因的PCR擴増以PK-15細胞cDNA為模板，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，AP2(x2、Elf4和ISCU基因分別在預(yù)期位置2601 bp、1989 bp和919 bp處出現(xiàn)特異性條帶，表明三種擴增產(chǎn)物正確（圖3.1)。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]抗豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白中和性單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 黃立平,劉長明,危艷武,張朝霞,陸月華,郭龍軍.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2009(02)
[2]豬圓環(huán)病毒2型免疫過氧化物酶單層細胞試驗抗體檢測試劑盒的研制及應(yīng)用[J]. 劉長明,張超范,危艷武,張朝霞,袁婧.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2007(08)
[3]豬圓環(huán)病毒2型細胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株的培育和鑒定[J]. 劉長明,張超范,危艷武,譚斌,陸月華,谷守林.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2006(03)
[4]酵母單雜交體系——一種研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的有效方法[J]. 廖名湘,方福德.  中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報. 2000(04)



本文編號：3124879