壞死梭桿菌（Fusobacteriumnecrophorum，F(xiàn)N）是革蘭氏陰性多形態(tài)厭氧菌，多存在于反芻動物壞死病灶中，引起人畜急性或慢性的壞死性疾病，是影響反芻動物健康的重要傳染病之一。本研究采用改良的提取工藝提取FN的外膜蛋白（outermembraneproteins,OMP），分光光度計測定其濃度4.524mg/ml，SDS-PAGE電泳圖譜顯示集中在44.5kDa左右（OMP44.5），Westernblot分析顯示，OMP44.5可以與兔抗血清結(jié)合，具有較好的免疫活性。通過小鼠攻毒實驗和小鼠巨噬細(xì)胞的MTS實驗發(fā)現(xiàn)OMP使小鼠臟器發(fā)生病變，細(xì)胞活力降低，表明OMP對小鼠細(xì)胞有毒性作用。在此基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)從FN基因組DNA中擴增OMP編碼基因片段，將其克隆在pMD-18TSimple上并測序，測序結(jié)果與GenBank公布的基因序列比對同源性100%。構(gòu)建pET-28a-OMP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）宿主菌中，IPTG誘導(dǎo)，鎳柱純化誘導(dǎo)表達(dá)的重組合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定，結(jié)果表明，OMP融合蛋白進行了有效表達(dá)并具有免疫... 

【文章來源】：江蘇科技大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 壞死梭桿菌
    1.2 壞死梭桿菌的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 流行病學(xué)
        1.2.2 病理變化
        1.2.3 致病機理
    1.3 細(xì)菌外膜蛋白的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 OMP的結(jié)構(gòu)
        1.3.2 OMP的致病機理
        1.3.3 OMP與 LPS
        1.3.4 OMP的免疫原性
    1.4 結(jié)束語
第2章 壞死梭桿菌外膜蛋白的粗提取及免疫活性分析
    2.1 材料
        2.1.1 菌種
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 儀器設(shè)備
        2.1.4 實驗動物
    2.2 方法
        2.2.1 菌種的復(fù)蘇
        2.2.2 OMP的提取
        2.2.3 SDS-PAGE 鑒定
        2.2.4 非變性蛋白質(zhì)電泳（ Native-page ）
        2.2.5 OMP含量測定
        2.2.6 Western blot
        2.2.7 小鼠體內(nèi)接種試驗
        2.2.8 接種小鼠病理學(xué)檢測
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 壞死梭桿菌的培養(yǎng)
        2.3.2 SDS-PAGE 鑒定
        2.3.3 非變性蛋白質(zhì)電泳
        2.3.4 OMP含量
        2.3.5 Western blot分析
        2.3.6 毒性檢測
        2.3.7 肝臟病理組織學(xué)檢測
    2.4 討論
        2.4.1 壞死梭桿菌的培養(yǎng)
        2.4.2 OMP的提取
        2.4.3 OMP的免疫活性與毒性
    2.5 本章小結(jié)
第3章 壞死梭桿菌外膜蛋白的原核表達(dá)及特性鑒定
    3.1 材料
        3.1.1 數(shù)據(jù)來源
        3.1.2 菌種和載體
        3.1.3 工具酶、試劑盒及主要試劑
        3.1.4 主要設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 設(shè)計引物
        3.2.2 目的基因的擴增
        3.2.3 目的基因克隆與鑒定
        3.2.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測
        3.2.6 重組蛋白和提取 OMP 對細(xì)胞的毒性
            3.2.6.1 培養(yǎng)細(xì)胞
            3.2.6.2 MTS 試驗
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 目的片段的克隆與鑒定
        3.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        3.3.3 誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.4 Western blot
        3.3.5 重組蛋白和提取 OMP 對細(xì)胞毒性試驗
    3.4 討論
        3.4.1 克隆質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.4.2 陽性質(zhì)粒的篩選
        3.4.3 誘導(dǎo)表達(dá)
        3.4.4 重組蛋白的免疫活性和對細(xì)胞的毒性
    3.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
附錄
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]腸致病性大腸桿菌外膜蛋白免疫保護性研究[J]. 李曉霞,邱玉玉,王海榮.  中國免疫學(xué)雜志. 2007(05)
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博士論文
[1]牛源致病性壞死梭桿菌分離鑒定及其白細(xì)胞毒素免疫特性研究[D]. 陳立志.吉林大學(xué) 2008
[2]牛羊腐蹄病壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素重組亞單位疫苗的研究[D]. 郭東華.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007

碩士論文
[1]雞奇異變形桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究[D]. 朱明華.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[2]致病性壞死梭桿菌分子檢測與基因分型[D]. 姚志利.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2010
[3]致病性壞死梭桿菌FN5株白細(xì)胞毒素特性研究[D]. 馮二凱.江蘇科技大學(xué) 2010
[4]兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及其外膜蛋白免疫效果的研究[D]. 肖海君.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號：3123659