通過研究培養(yǎng)條件（包括血清濃度、飼養(yǎng)層細(xì)胞及三種生長因子）對水牛精原干細(xì)胞（SSCs）增殖的影響,最終建立水牛SSCs體外增殖的培養(yǎng)體系。通過介導(dǎo)生長抑素RNA干擾的PB轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染SSCs,得到含目的基因片段的SSCs;在移植轉(zhuǎn)基因SSCs至昆明鼠睪丸后,分析轉(zhuǎn)基因SSCs的增殖與分化功能。該研究為克隆轉(zhuǎn)基因水牛提供新途徑；為SSCs的生物學(xué)特性、多潛能性及定向分化的表觀遺傳學(xué)和精子發(fā)生機(jī)理等研究提供技術(shù)平臺；結(jié)合SSCs的冷凍保存,為水牛的種質(zhì)資源保存提供新手段；為其他家畜和人的SSCs的研究提供理論參考。1.水牛精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與分子標(biāo)志探索水牛SSCs特異性分子標(biāo)志的發(fā)展,體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及其多能性的保持,在水牛的選擇性遺傳修飾中具有重要的意義。本研究取4～5月齡雜交水牛（摩拉×沼澤,49條染色體）睪丸,經(jīng)Western blot發(fā)現(xiàn)水牛睪丸中存在兩種蛋白異構(gòu)體（135kDa大片段和90kDa小片段）,CDH1為水牛精原干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志；免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)水牛睪丸精原細(xì)胞上存在CDH1的表達(dá),且在體細(xì)胞中無表達(dá)。純化后的精原干細(xì)胞（流式分析純化富集效率達(dá)到53%）... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 精原干細(xì)胞內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制研究進(jìn)展
        1.1 精原干細(xì)胞的起源
        1.2 精原干細(xì)胞的生物活性
        1.3 SSC龕內(nèi)因子
    2 SSCs表面表型的研究進(jìn)展
        2.1 表面表型的初步理解
        2.2 造血干細(xì)胞和SSCs表面表型的共性
        2.3 GDNF的受體復(fù)合物作為一種特定的SSCs表型
        2.4 水牛SSCs表面表型的研究進(jìn)展
    3 外源生長因子對精原干細(xì)胞自我更新的影響
        3.1 GDNF影響SSCs的增殖和正常生精功能
        3.2 嚙齒動物SSCs的體外長期培養(yǎng)體系
        3.3 GDNF與精原干細(xì)胞體外長期自我更新
        3.4 bFGF和EGF與SSCs體外自我更新
        3.5 其他體外培養(yǎng)添加物進(jìn)展
    4 生長抑素
    5 PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)RNAi技術(shù)
    6 SSCs移植介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的研究進(jìn)展
        6.1 SSCs的移植
        6.2 移植前轉(zhuǎn)基因
    7 本項(xiàng)目的研究目的和意義
第二章 水牛精原干細(xì)胞（SSCS）分子標(biāo)志篩查與體外培養(yǎng)
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 材料
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
            2.1.2 主要儀器和材料
            2.1.3 主要試劑
        2.2 方法
            2.2.1 試劑配制
            2.2.2 樣品的采集
            2.2.3 免疫組化
            2.2.4 Western blot檢測
            2.2.5 精原細(xì)胞的分離
            2.2.6 水牛精原干細(xì)胞的純化
            2.2.7 流式細(xì)胞分析
            2.2.8 飼養(yǎng)層準(zhǔn)備
            2.2.9 精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)
            2.2.10 精原細(xì)胞克隆的增殖分析
            2.2.11 免疫細(xì)胞化學(xué)
            2.2.12 克隆分離和RT-PCR、qRT-PCR檢測
            2.2.13 供體細(xì)胞移植
            2.2.14 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果與討論
        3.1 CDH1的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)
        3.2 水牛睪丸組織中CDH1定位
        3.3 水牛睪丸組織CDH1蛋白表達(dá)
        3.4 水牛SSCs的分離和純化效率
        3.5 體外培養(yǎng)的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）
        3.6 清飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中水牛SSCs增殖和克隆數(shù)
        3.7 生長因子培養(yǎng)體系中水牛SSCs增殖和克隆數(shù)
        3.8 體外培養(yǎng)SSCs克隆中特異性分子標(biāo)志表達(dá)
        3.9 生長因子對SSCs克隆的分子標(biāo)志mRNA水平表達(dá)的影響
        3.10 水牛SSCs在受體睪丸中的定植
    4 討論
        4.1 CDH1在水牛精原干細(xì)胞中的表達(dá)與定位
        4.2 水牛SSCs純化效果
        4.3 水牛SSCs體外培養(yǎng)中增殖特性
        4.4 血清與飼養(yǎng)層體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化
        4.5 生長因子對水牛精原干細(xì)胞在體外增殖的影響
第三章 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建與功能驗(yàn)證
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 試驗(yàn)動物和細(xì)胞
            2.1.2 干擾載體
            2.1.3 所用試劑
            2.1.4 主要試劑盒
            2.1.5 主要抗體
        2.2 方法
            2.2.1 SS基因RNA干擾載體構(gòu)建
            2.2.2 SS干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞
            2.2.3 細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄
            2.2.4 qRT-PCR檢測質(zhì)粒在mRNA水平的干擾效率
            2.2.5 生長抑素表達(dá)水平檢測
            2.2.6 流式檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡
            2.2.7 流式檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期
            2.2.8 轉(zhuǎn)染后凋亡和周期相關(guān)蛋白檢測
            2.2.9 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 生長抑素RNAi載體構(gòu)建
            3.1.1 設(shè)計(jì)及合成的shRNA
            3.1.2 雙鏈退火得到shRNA
            3.1.3 ph1載體質(zhì)粒驗(yàn)證結(jié)果
            3.1.4 真核表達(dá)干擾質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
        3.2 生長抑素干擾載體的轉(zhuǎn)染結(jié)果
            3.2.1 轉(zhuǎn)染效果
            3.2.2 所提總RNA的質(zhì)量
            3.2.3 細(xì)胞激素水平的干擾效率
            3.2.4 細(xì)胞在mRNA水平的干擾效果
        3.3 轉(zhuǎn)染SS干擾質(zhì)粒對BHK-21細(xì)胞的影響
            3.3.1 轉(zhuǎn)染對細(xì)胞周期的影響
            3.3.2 轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡的影響
            3.3.3 轉(zhuǎn)染對BHK-21細(xì)胞生長抑素受體的影響
    4 討論
        4.1 關(guān)于干擾效果的討論
        4.2 干擾SS后BHK-21細(xì)胞凋亡和周期變化
        4.3 干擾SS對BHK-21細(xì)胞SSTR的影響
    5 小結(jié)
第四章 水牛SSCs的異種移植
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器與耗材
            2.1.3 動物
        2.2 方法
            2.2.1 檢測昆明小鼠對白消安的劑量反應(yīng)
            2.2.2 移植
            2.2.3 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 劑量反應(yīng)
            3.1.1 受體小鼠的體重變化
            3.1.2 受體小鼠睪酮水平變化
            3.1.3 受體小鼠睪丸組織學(xué)變化
        3.2 供體細(xì)胞準(zhǔn)備
            3.2.1 水牛SSCs的體外轉(zhuǎn)染效果
            3.2.2 供體細(xì)胞熒光鏡檢及移植
        3.3 移植后的受體睪丸分析結(jié)果
            3.3.1 受體睪丸中供體SSCs的增殖狀況
            3.3.2 受體睪丸中供體細(xì)胞PCR檢測結(jié)果
    4 討論
        4.1 白消安劑量優(yōu)化
        4.2 SSCs轉(zhuǎn)基因途徑
        4.3 受體睪丸中供體SSCs鑒定
        4.4 受體睪丸中供體SSCs的增殖和分化
    5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
研究創(chuàng)新點(diǎn)
不足
附錄Ⅰ 重組ph1質(zhì)粒測序圖譜
附錄Ⅱ 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論著/論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]生長抑素基因免疫對湖羊羔羊生長及GH和IGF-Ⅰ的影響[J]. 薛春林,茆達(dá)干,程瑞禾,方永飛,楊利國.  中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2006(04)
[2]RNAi-DNA穩(wěn)定表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用[J]. 周唏,張鵬輝.  現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生. 2005(24)
[3]影響基因疫苗免疫效果的因素[J]. 茆達(dá)干,楊利國,曹少先.  中國免疫學(xué)雜志. 2004(05)
[4]抑制素α（1～32）基因免疫對大鼠卵泡發(fā)育和生殖激素的影響[J]. 茆達(dá)干,楊利國,葉榮,姜勛平.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2003(12)
[5]生長抑素基因工程疫苗對生長肥育豬促生長效果試驗(yàn)[J]. 石旭東,殷輝林,張小琳.  養(yǎng)豬. 2001(04)
[6]幾種因素對培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞的影響[J]. 張學(xué)明,李子義,賴良學(xué),文興豪,李德雪,岳占碰,杜惜明.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2001(05)

碩士論文
[1]新生牛精原干細(xì)胞體外增殖調(diào)控的研究[D]. 張仕強(qiáng).西北農(nóng)林科技大學(xué) 2007



本文編號：3110585