動物大多從受精卵開始發(fā)育,通過細(xì)胞增殖和分化逐漸形成胚胎,繼而形成胎兒,最終發(fā)育為成體。動物生長發(fā)育是遺傳因素與環(huán)境共同作用的結(jié)果。對家畜的生長發(fā)育的研究有利于提高家畜的生產(chǎn)性能,提高畜牧業(yè)的效益。為了探索牛胎兒生長發(fā)育的機理,本研究選取牛體型的候選功能基因PLAG1作為研究的對象,通過研究PLAG1在體外成肌細(xì)胞及軟骨細(xì)胞中的作用來初步闡明其對生長發(fā)育的調(diào)控機制。主要通過siRNA干擾、腺病毒感染過表達(dá)PLAG1、CCK8分析及mRNA-seq等方法,研究PLAG1對牛胎兒骨骼肌來源的成肌細(xì)胞及長骨軟骨來源的軟骨細(xì)胞的增殖與相關(guān)基因表達(dá)的影響,通過ChIP-qPCR研究PLAG1的靶基因并探究其作用機理。得到主要結(jié)果如下:1、通過膠原酶消化法分離3月齡的小牛胎兒骨骼肌來源的成肌細(xì)胞,在增殖期利用siRNA干擾PLAG1,在干擾1天后,干擾組GHR和INSR表達(dá)量都顯著高于陰性對照組（P<0.05）,而IGF1R和IGF2表達(dá)量都顯著低于陰性對照組（P<0.05）,在干擾2天后,干擾組僅有IGF1R和IGF2表達(dá)量顯著低于陰性對照組（IGF1R P<0.01,IGF2... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

牛PLAG1-CHCHD7基因區(qū)間雙向啟動子的序列變體(JUMAetal.,2016)

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章結(jié)果與分析22第三章結(jié)果與分析3.1牛胎兒成肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)結(jié)果本試驗所使用的成肌細(xì)胞來自于3月齡大小的荷斯坦胎牛，剝離胎牛背最長肌組織，加入膠原酶消化過濾后得到單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)24h，取出在顯微鏡下觀察，可以看到細(xì)胞呈貼壁式生長，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)三角形，如圖3-1圖a，繼續(xù)培養(yǎng)至70-80%，細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形，如圖3-1圖b。圖3-1牛胎兒肌肉來源的成肌細(xì)胞形態(tài)Fig.3-1Themorphologyofbovinefetalmusclederivedmyoblast注：Bar：100μm3.2干擾PLAG1對成肌細(xì)胞的影響結(jié)果3.2.1siRNA的設(shè)計及在成肌細(xì)胞中干擾效率的檢測結(jié)果根據(jù)NCBI檢索到的牛PLAG1mRNA序列及預(yù)測的可能轉(zhuǎn)錄本序列，于4條轉(zhuǎn)錄本的共有序列處設(shè)計3條小干擾RNA（siRNA），序列見表3-1。用脂質(zhì)體法將siRNA轉(zhuǎn)入成肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞檢測siRNA的干擾效率。由圖3-2qPCR結(jié)果可以看出，三條siRNA中干擾效果最好的為siRNA-002,因此我們選擇siRNA-002開展后續(xù)試驗。siRNA-002干擾PLAG148h后細(xì)胞形態(tài)無明顯的改變。表3-1siRNA的靶序列Table3-1TargetsequencesofsiRNAssiRNA名稱（Name）序列Sequences（5"→3"）si-PLAG1_001GGAAGGAAGGACTTCCTCTsi-PLAG1_002GCTGAACCTCTACAACACTsi-PLAG1_003CAGCATTGGATTTCTCTCA

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章結(jié)果與分析23圖3-2成肌細(xì)胞中siRNA干擾效率檢測Fig.3-2TheefficiencytestofsiRNAinterferenceinmyoblasts3.2.2干擾PLAG1對成肌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)量的影響結(jié)果在成肌細(xì)胞增殖過程中干擾PLAG1的表達(dá)，并于干擾后的1天和2天分別收取細(xì)胞樣品檢測mRNA表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)PLAG1的表達(dá)量都有顯著的下降。在干擾1天后，INSR和GHR表達(dá)量都顯著高于陰性對照組（P<0.05），而IGF1R和IGF2表達(dá)量都顯著低于陰性對照組（P<0.05），其他基因表達(dá)量無明顯變化，如圖3-3左圖所示。而在干擾2天后，我們發(fā)現(xiàn)，干擾組僅有IGF1R和IGF2表達(dá)量顯著低于陰性對照組（IGF1RP<0.01,IGF2P<0.05），而其他基因的表達(dá)量與對照組相比無明顯差異，如圖3-3右圖所示。綜合兩天的結(jié)果來看，在干擾PLAG1后，表達(dá)量一直受到顯著影響的基因是IGF1R和IGF2。圖3-3干擾PLAG1后相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)水平Fig.3-3TherelativemRNAexpressionlevelafterinterferingwithsiPLAG1

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]S100a10基因?qū)π∈笄绑w脂肪細(xì)胞白色和棕色成脂分化的影響[J]. 任玲,胡鑫,邢義珅,王亞慧,李俊雅,張路培.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2019(06)
[2]小鼠關(guān)節(jié)軟骨表層細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定[J]. 譚喬燕,王權(quán),曠梁,謝楊麗,李燦,羅鳳濤,杜曉蘭,陳林.  國際骨科學(xué)雜志. 2018(05)
[3]馬鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化過程表面標(biāo)志物的特征性變化[J]. 王姍姍,鄭永富,馬夢婷,高慶華,韓春梅.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2016(10)

碩士論文
[1]牛肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)候選基因S100A10和bta-miR-210的生物學(xué)功能研究[D]. 任玲.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[2]NCAGP基因?qū)εＬ汗趋兰碓吹某杉〖?xì)胞有絲分裂和成肌分化的影響及機理研究[D]. 邢義珅.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2018



本文編號：3110130