球蟲病是世界上危害嚴(yán)重的寄生蟲病之一,對養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著藥物的廣泛使用及不合理使用,耐藥性成為無法避免的問題,但球蟲耐藥性形成的機(jī)制至今不清楚,也沒有找到控制球蟲產(chǎn)生耐藥性的靶基因。本研究通過實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)獲得了柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素耐藥蟲株,觀察了鹽霉素耐藥株和敏感株子孢子和裂殖子的超微結(jié)構(gòu),分析了鹽霉素耐藥株和敏感株的差異表達(dá)基因,檢測了3個(gè)雞球蟲田間分離株的耐藥狀況,利用單卵囊分離技術(shù)獲得22個(gè)柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素田間耐藥株,對檸檬酸合酶（EtCS）、甲硫氨酸氨基肽酶（EtMetAP）、錨蛋白重復(fù)序列（EtANK）3個(gè)球蟲耐藥相關(guān)基因的特性進(jìn)行了初步分析。1.柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素耐藥株的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)與電鏡觀察采用藥物濃度遞增法,以15 mg/kg（藥物/飼料）為起始誘導(dǎo)濃度,經(jīng)過24次傳代,用雞體藥敏試驗(yàn)檢測,獲得對鹽霉素60 mg/kg完全耐藥的柔嫩艾美耳球蟲耐藥株。利用透射電鏡觀察了鹽霉素耐藥株子孢子和裂殖子的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)耐藥株蟲體的形態(tài)變得不規(guī)則、細(xì)胞膜粗糙與腫脹、細(xì)胞核形狀變得不規(guī)則甚至溶解、微線減少、支鏈淀粉增多等。2.柔嫩艾美耳球蟲敏感株和耐藥株的比較轉(zhuǎn)錄組... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

柔嫩艾美耳球蟲敏感株和鹽霉素耐藥株子孢子和裂殖子超微結(jié)構(gòu)

的總RNA是否可以用于建庫。3.2.7.2敏感株和鹽霉素耐藥株子孢子和第二代裂殖子cDNA文庫的構(gòu)建和IlluminaHiSeqTM測序1）RNA樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠，通過A-T互補(bǔ)配對與mRNA的ployA尾結(jié)合的方式富集敏感株和鹽霉素耐藥株子孢子和第二代裂殖子的mRNA。2）將mRNA變成短片段，用隨機(jī)引物使其反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。3）純化cDNA，進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，選擇片段大小，富集獲得cDNA文庫。4）將文庫稀釋成1ng/μL，插入片段合格后，用qPCR定量文庫的濃度，確保質(zhì)量。5）文庫合格后進(jìn)行測序，具體流程見圖3-1。圖3-1建庫測序流程Figure3-1Databasebuildingandsequencingprocess3.2.7.3敏感株和鹽霉素耐藥株子孢子和第二代裂殖子測序數(shù)據(jù)生物信息分析將測序獲得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成序列，通過測序錯(cuò)誤率分布檢查，A/T/G/C含量分布檢查，去除低質(zhì)量、有接頭的reads等獲得cleanreads進(jìn)行質(zhì)量評估。將獲得的cleanreads與柔嫩艾美耳球蟲基因組v8.1（www.toxodb.org）（REIDetal，2014）進(jìn)行對比，對基因表達(dá)水平、相關(guān)性、差異表達(dá)水平進(jìn)行分析，具體的流程見圖3-2.

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章柔嫩艾美耳球蟲敏感株與鹽霉素耐藥株差異基因的論篩選與驗(yàn)證22圖3-2生物信息分析流程Figure3-2Bioinformaticsanalysisprocess3.2.8敏感株和鹽霉素耐藥株子孢子和第二代裂殖子差異表達(dá)基因的驗(yàn)證3.2.8.1敏感株和鹽霉素耐藥株子孢子和第二代裂殖子RNA的提取參考2.2.7提取敏感株和耐藥株的子孢子和第二代裂殖子。3.2.8.2敏感株和鹽霉素耐藥株子孢子和第二代裂殖子基因組DNA的去除及RNA的純化1）去除基因組DNA的實(shí)驗(yàn)體系如表3-3所示。表3-3實(shí)驗(yàn)體系Table3-3Systemfortheexperiment試劑體積總RNA30μgRNaseInhibitor2μL10×DNaseΙbufferi5μLDNaseΙ(RNaseFree)2μLRNase-FreeWater11μLTotal50μL2）上述溶液吹打混勻，于37℃水浴鍋中孵育30min，輕微離心混勻，冰上靜置5min。3）參照RNAeasyMiniKit試劑盒使用說明書純化RNA。3.2.8.3敏感株和鹽霉素耐藥株子孢子和第二代裂殖子cDNA的合成及純化表3-4實(shí)驗(yàn)體系Table3-4Systemfortheexperiment試劑體積總RNA11μgRangdomprimer1μLTotal12μL

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3107791