Wnt信號(hào)通路存在于所有真核多細(xì)胞生物,是生物體內(nèi)細(xì)胞發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵途徑,具有非常重要的作用,目前,我們已在日本血吸蟲(chóng)體內(nèi)找到Wnt信號(hào)通路的各種成員,已證實(shí)的日本血吸蟲(chóng)Wnt信號(hào)通路配體有Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5、Wnt11,受體有Fz5、Fz7、Fz8、Fz9。Wnt信號(hào)通路中的受配體相互作用是此通路的起始,理清日本血吸蟲(chóng)Wnt信號(hào)通路的受配體之間相互作用,可推測(cè)血吸蟲(chóng)中可能存在的信號(hào)通路的激活方式,進(jìn)一步了解日本血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制,豐富日本血吸蟲(chóng)發(fā)育生物學(xué)的內(nèi)容。因此本研究在前期工作的基礎(chǔ)上將對(duì)Wnt信號(hào)通路受配體進(jìn)行真核載體構(gòu)建,并篩選出最佳蛋白表達(dá)效果,為受配體交互研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。利用免疫共沉淀技術(shù)從分子水平來(lái)篩選和分析日本血吸蟲(chóng)Wnt/Fz交互的特異性。1.日本血吸蟲(chóng)Wnt信號(hào)通路受配體真核載體構(gòu)建采用巢式PCR方法,對(duì)日本血吸蟲(chóng)Wnts ORF去除信號(hào)肽的部分,以及Fzs的CRD部分進(jìn)行特異性擴(kuò)增。其中Fz5構(gòu)建了含5’UTR和不含5’UTR兩種真核載體,以比較表達(dá)蛋白的量是否受上游非編碼序列的調(diào)控。將p3xFLAG-CMV-7.1載體用... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

Wnt4、Fzs巢式PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠分析

圖2.3 WntK \Vnt2分段PCR產(chǎn)物諒脂糖凝膠分析Figure 2.3 Electrophoresis analysis of Wntl gene and Wnt2 gene amplified by PCR in agorose gel注：M;DNA marker DL 2000： A屮的1為Wml去掉信號(hào)肽的ORF片段3’ PCR忙增；B屮的2為Wntl去抑倍號(hào)肽的ORF片段5’ PCR擴(kuò)斯C屮的3為Wnt2去掉信弓-肽的ORF片段3’ PCR擴(kuò)增；D屮的4為Wnt2去掉信號(hào)肽的ORF片段5’ PCR擴(kuò)增《te:M:DNA marker DL 2000;lane 1 represents amplification for 3'PCR of Wntl ORF fragments were removed signal peptide in picture A;lane

myc標(biāo)簽蛋白（圖2.5)，插入ffi基因Fzs CRD序列后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，目的蛋白也將在胞獎(jiǎng)內(nèi)表達(dá)，便于Wnts與Fzs相互作用；真核表達(dá)載體PRK5經(jīng)過(guò)改造后，含有myc標(biāo)簽（圖2.6)，插入祀基因Fz5的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，目的蛋白將在胞衆(zhòng)進(jìn)行表達(dá)，便于Wnts與Fz5相互作用。而載體上標(biāo)簽的存在，使得目的蛋白的跟蹤與檢測(cè)變得更加簡(jiǎn)化。本部分實(shí)驗(yàn)在載體上選擇雙酶切位點(diǎn)，同時(shí)在擴(kuò)增的上下游引物上引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，采用定向克隆的方式插入目的基因，進(jìn)行真核載體構(gòu)建

【參考文獻(xiàn)】：
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