豬輪狀病毒感染（Porcine rotavirus, PoRV）是一種嚴(yán)重的接觸性腸道傳染病,導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和消瘦等臨床癥狀,也能夠致使仔豬死亡,特別是對(duì)7日齡左右的仔豬造成的危害最為嚴(yán)重。該病主要暴發(fā)于寒冷時(shí)期的冬季以及早春時(shí)節(jié),且傳播迅速,給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的損失�，F(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室對(duì)PoRV病原的檢測(cè)主要是利用常規(guī)RT-PCR方法,但是常規(guī)RT-PCR方法相對(duì)于熒光定量RT-PCR靈敏度較低。常規(guī)RT-PCR只能檢測(cè)到發(fā)病嚴(yán)重時(shí)期的豬只,對(duì)輪狀病毒感染早期的豬只,則需要靈敏度更高的檢測(cè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn),以達(dá)到在豬感染的潛伏期就可以診斷并采取有效的防控措施來(lái)減少PoRV的暴發(fā)帶來(lái)的損失。本試驗(yàn)主要是為臨床檢測(cè)PoRV建立靈敏性更高的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)GenBank中登錄的A群豬輪狀病毒（PoRV）TM-a毒株序列,我們針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白VP6基因設(shè)計(jì)了一對(duì)常規(guī)RT-PCR特異性引物和一對(duì)熒光定量RT-PCR特異性引物和探針,將通過(guò)常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增VP6獲得的目的片段與pMD-18T載體連接構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒,建立了檢測(cè)A群PoRV的TaqMan熒光定量RT-P... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 輪狀病毒的歷史
    1.2 輪狀病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和基因組
    1.3 輪狀病毒的理化特性和培養(yǎng)特性
    1.4 輪狀病毒的流行病學(xué)
    1.5 輪狀病毒感染的臨床癥狀和病理變化
    1.6 輪狀病毒的診斷方法研究進(jìn)展
    1.7 輪狀病毒感染的免疫機(jī)制
        1.7.1 局部黏膜免疫保護(hù)機(jī)制
        1.7.2 體液免疫
        1.7.3 細(xì)胞免疫
        1.7.4 其他非免疫機(jī)制
    1.8 熒光定量RT-PCR原理與應(yīng)用
        1.8.1 定量原理
        1.8.2 FQ-PCR反應(yīng)方法的分類
            1.8.2.1 非特異性DNA結(jié)合染料法
            1.8.2.2 TaqMan探針
            1.8.2.3 分子信標(biāo)
            1.8.2.4 雜交探針
            1.8.2.5 復(fù)合探針
        1.8.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用
2 研究的目的與意義
3 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、細(xì)胞及臨床病料
        3.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要試劑和藥品
        3.1.5 主要培養(yǎng)基的配置
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì)
        3.2.2 病毒核酸的提取
            3.2.2.1 DNA病毒Total DNA的提取
            3.2.2.2 RNA病毒Total RNA的提取
            3.2.2.3 cDNA的制備
        3.2.3 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
            3.2.3.1 引物的設(shè)計(jì)
            3.2.3.2 目的片段的擴(kuò)增
            3.2.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化
            3.2.3.4 純化產(chǎn)物與載體的連接
            3.2.3.5 感受態(tài)制備
            3.2.3.6 轉(zhuǎn)化
            3.2.3.7 質(zhì)粒的大量提取
            3.2.3.8 質(zhì)粒的鑒定
        3.2.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系的建立
        3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
        3.2.6 特異性試驗(yàn)
        3.2.7 敏感性試驗(yàn)
        3.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)
        3.2.9 臨床病例的檢測(cè)
        3.2.10 PoRV細(xì)胞培養(yǎng)物的檢測(cè)
        3.2.11 人工動(dòng)物試驗(yàn)
        3.2.12 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR
            3.2.12.1 試驗(yàn)動(dòng)物組織中病毒RNA的提取
            3.2.12.2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)
        3.2.13 組織切片制備
        3.2.14 HE染色
        3.2.15 免疫組化法檢測(cè)試驗(yàn)豬的病毒含量情況
4 結(jié)果與分析
    4.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
    4.2 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
    4.3 特異性試驗(yàn)
    4.4 敏感性試驗(yàn)
    4.5 重復(fù)性試驗(yàn)
    4.6 臨床病例的檢測(cè)
    4.7 PoRV細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒載量的檢測(cè)
    4.8 人工動(dòng)物試驗(yàn)
    4.9 熒光定量RT-PCR檢測(cè)人工感染豬糞便排毒量
    4.10 病理學(xué)檢測(cè)
        4.10.1 HE染色檢測(cè)
        4.10.2 免疫組化法對(duì)病毒的檢測(cè)
5 討論
    5.1 熒光定量PCR技術(shù)討論
    5.2 豬輪狀病毒致病特性
    5.3 豬輪狀病毒的排毒規(guī)律探討
    5.4 試驗(yàn)中需要注意的問(wèn)題
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3083031