豬輪狀病毒感染（Porcine rotavirus, PoRV）是一種嚴重的接觸性腸道傳染病,導致仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和消瘦等臨床癥狀,也能夠致使仔豬死亡,特別是對7日齡左右的仔豬造成的危害最為嚴重。該病主要暴發(fā)于寒冷時期的冬季以及早春時節(jié),且傳播迅速,給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的損失�，F(xiàn)階段實驗室對PoRV病原的檢測主要是利用常規(guī)RT-PCR方法,但是常規(guī)RT-PCR方法相對于熒光定量RT-PCR靈敏度較低。常規(guī)RT-PCR只能檢測到發(fā)病嚴重時期的豬只,對輪狀病毒感染早期的豬只,則需要靈敏度更高的檢測方法來實現(xiàn),以達到在豬感染的潛伏期就可以診斷并采取有效的防控措施來減少PoRV的暴發(fā)帶來的損失。本試驗主要是為臨床檢測PoRV建立靈敏性更高的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)GenBank中登錄的A群豬輪狀病毒（PoRV）TM-a毒株序列,我們針對結(jié)構(gòu)蛋白VP6基因設(shè)計了一對常規(guī)RT-PCR特異性引物和一對熒光定量RT-PCR特異性引物和探針,將通過常規(guī)RT-PCR擴增VP6獲得的目的片段與pMD-18T載體連接構(gòu)建標準陽性質(zhì)粒,建立了檢測A群PoRV的TaqMan熒光定量RT-P... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 文獻綜述
    1.1 輪狀病毒的歷史
    1.2 輪狀病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和基因組
    1.3 輪狀病毒的理化特性和培養(yǎng)特性
    1.4 輪狀病毒的流行病學
    1.5 輪狀病毒感染的臨床癥狀和病理變化
    1.6 輪狀病毒的診斷方法研究進展
    1.7 輪狀病毒感染的免疫機制
        1.7.1 局部黏膜免疫保護機制
        1.7.2 體液免疫
        1.7.3 細胞免疫
        1.7.4 其他非免疫機制
    1.8 熒光定量RT-PCR原理與應用
        1.8.1 定量原理
        1.8.2 FQ-PCR反應方法的分類
            1.8.2.1 非特異性DNA結(jié)合染料法
            1.8.2.2 TaqMan探針
            1.8.2.3 分子信標
            1.8.2.4 雜交探針
            1.8.2.5 復合探針
        1.8.3 實時熒光定量PCR的應用
2 研究的目的與意義
3 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、細胞及臨床病料
        3.1.2 試驗動物
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要試劑和藥品
        3.1.5 主要培養(yǎng)基的配置
    3.2 試驗方法
        3.2.1 引物與探針的設(shè)計
        3.2.2 病毒核酸的提取
            3.2.2.1 DNA病毒Total DNA的提取
            3.2.2.2 RNA病毒Total RNA的提取
            3.2.2.3 cDNA的制備
        3.2.3 陽性標準質(zhì)粒的制備
            3.2.3.1 引物的設(shè)計
            3.2.3.2 目的片段的擴增
            3.2.3.3 擴增產(chǎn)物的回收與純化
            3.2.3.4 純化產(chǎn)物與載體的連接
            3.2.3.5 感受態(tài)制備
            3.2.3.6 轉(zhuǎn)化
            3.2.3.7 質(zhì)粒的大量提取
            3.2.3.8 質(zhì)粒的鑒定
        3.2.4 實時定量RT-PCR反應體系的建立
        3.2.5 標準曲線的制備
        3.2.6 特異性試驗
        3.2.7 敏感性試驗
        3.2.8 重復性試驗
        3.2.9 臨床病例的檢測
        3.2.10 PoRV細胞培養(yǎng)物的檢測
        3.2.11 人工動物試驗
        3.2.12 實時熒光定量RT-PCR
            3.2.12.1 試驗動物組織中病毒RNA的提取
            3.2.12.2 熒光定量RT-PCR檢測
        3.2.13 組織切片制備
        3.2.14 HE染色
        3.2.15 免疫組化法檢測試驗豬的病毒含量情況
4 結(jié)果與分析
    4.1 標準質(zhì)粒的制備
    4.2 熒光定量RT-PCR反應體系的建立及標準曲線的制備
    4.3 特異性試驗
    4.4 敏感性試驗
    4.5 重復性試驗
    4.6 臨床病例的檢測
    4.7 PoRV細胞培養(yǎng)物中病毒載量的檢測
    4.8 人工動物試驗
    4.9 熒光定量RT-PCR檢測人工感染豬糞便排毒量
    4.10 病理學檢測
        4.10.1 HE染色檢測
        4.10.2 免疫組化法對病毒的檢測
5 討論
    5.1 熒光定量PCR技術(shù)討論
    5.2 豬輪狀病毒致病特性
    5.3 豬輪狀病毒的排毒規(guī)律探討
    5.4 試驗中需要注意的問題
6 結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3083031