雞傳染性喉氣管炎（ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）引起的急性呼吸道疾病,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前ILT的防控主要依賴疫苗接種,常用的疫苗是減毒活疫苗。但是減毒疫苗容易引起毒力返強(qiáng),導(dǎo)致本病的發(fā)生和流行。因此,建立ILTV抗體的檢測方法,以及研制保護(hù)力好、安全性高的新型疫苗,對于ILT的防控具有重要意義。本研究通過對ILTV Anhui-2011-2株gD基因所編碼蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析,用PCR擴(kuò)增編碼gD糖蛋白胞外區(qū)的基因片段（253nt～1218nt）,并克隆到供體質(zhì)粒pFastBacHTA中。將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac/AcMNPV中進(jìn)行轉(zhuǎn)座,再經(jīng)過篩選純化得到穿梭質(zhì)粒Bacmid-gD。用脂質(zhì)體介導(dǎo)穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,得到重組桿狀病毒AcMNPV-gD。用Western-blot可以檢測到AcMNPV-gD的表達(dá)產(chǎn)物大小為50KD左右,并且與雞抗ILTV多抗血清特異性結(jié)合。以高親和Ni-NTA層析樹脂純化重組桿狀病毒表達(dá)的gD蛋白,建立了檢測ILTV抗體的間接ELISA方法。該方法與BioChek公司商品化試劑盒相比符合率為93.02%,與新城... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：43 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

ILTV基因組結(jié)構(gòu)

圖2-1 gD基因表達(dá)盒示意圖Fig, 2-1 Illustration of gD gene expression cassette引物序列如下：gD/F:5'-GTTGAATTCGTCACGTACGACTACATTTTAGG-3'EcoR I酶切位點gD/R:5'-GTTGGTACCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGAGACGGCATTAGAACTTKpn I酶切位點引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。.1.2 ILTV gD基因的克隆與測序1)gD基因片段的克隆將毒株ILTV Anhui-2011-2接種到長至80%的單層LMH細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)到80

由于Bacmid中攜帶的mini-attTn7轉(zhuǎn)座子兩側(cè)分別帶有M13Forward (-40)和M13Reverse通用引物序列（圖2-2)，可以用于重組穿梭質(zhì)粒的鑒定，如果轉(zhuǎn)座成功，則含有g(shù)D基因片段的PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為3426 bp。PCR各參數(shù)設(shè)置如下：94°C預(yù)變性5min;94°C 變性 45s，55X：退火 45s, 72°C 延伸 4min，共 30 個循環(huán)；72°C 延伸 lOmin。PCR 產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。Transposed ^^^^^pFastBac?sequenceBacmid DNA 2430 bp M13(-40)F orward M13 Reverse圖2-2重組Bacmid鑒定示意圖Fig. 2-2 Illustration of identification for recombinant Bacmid


本文編號：3081763