乙型腦炎（JE）是由乙型腦炎病毒（JEV）引起的一種以蟲蚊為傳播媒介的人畜共患傳染病。JEV主要在豬—蚊—人這一循環(huán)中傳播,其中豬是JEV重要的擴(kuò)增貯存宿主,人是JEV的終末宿主。JEV感染的患者多數(shù)呈隱性感染,即使治愈后也會(huì)留有不可逆的腦部的炎癥和嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷,并且給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前JEV的生物信息學(xué),免疫學(xué)方面及臨床治療等方面取得了一定的進(jìn)展,同時(shí)疫苗的大量普及使得乙腦的發(fā)病率控制在一定范圍之內(nèi),但是在JEV感染的分子機(jī)制方面還不是很清楚。目前24種整合素中的1/3識(shí)別不同病毒RGD序列,其中包括αββ3�，F(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)它是口蹄疫病毒,腺病毒及某些黃病毒的功能性受體。JEV的囊膜蛋白E蛋白包括三個(gè)區(qū)域,其中結(jié)構(gòu)域Ⅲ中的RGD序列,被推測(cè)認(rèn)為是與受體結(jié)合的主要部位,能夠介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的膜融合。本研究通過(guò)構(gòu)建JEV感染性克隆,獲得拯救的JEV病毒粒子,并對(duì)其進(jìn)行一系列的生物學(xué)鑒定,多次傳代證實(shí)病毒粒子能穩(wěn)定遺傳。同時(shí)開(kāi)展整合素蛋白αv/β3對(duì)JEV復(fù)制的影響,探究其作為JEV功能性受體的可能性,為JEV入侵細(xì)胞機(jī)制的研究及今后抗JEV病毒新型藥物研制提供理... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞（Abbreviation）
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 乙型腦炎的流行病學(xué)及歷史
    1.2 JEV的病原學(xué)特性
        1.2.1 JEV理化特性
        1.2.2 JE的生物學(xué)特性
        1.2.3 JE的增殖特性
        1.2.4 JEV的致病機(jī)制
    1.3 JEV分子生物學(xué)特性
        1.3.1 JEV的基因組結(jié)構(gòu)
        1.3.2 JEV的主要結(jié)構(gòu)蛋白-E蛋白
    1.4 JEV感染的主要臨床癥狀和病理變化
        1.4.1 JEV感染的臨床癥狀及致病性
        1.4.2 JEV感染的病理變化
    1.5 JE的診斷及防治
    1.6 整合素的研究進(jìn)展
        1.6.1 整合素的基因結(jié)構(gòu)
        1.6.2 整合素的配體及分類
        1.6.3 整合素的活化機(jī)制-構(gòu)象改變
        1.6.4 整合素的作用
        1.6.5 整合素αvβ3的簡(jiǎn)介
2 研究目的和意義
3 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 毒株、細(xì)胞與菌株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 工具酶和主要試劑
        3.1.4 主要培養(yǎng)基及其配制
        3.1.5 相關(guān)緩沖液與試劑及其配制
        3.1.6 本研究所使用的引物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
            3.2.1.1 感受態(tài)細(xì)胞制備（以大腸桿菌DH5α為例）
            3.2.1.2 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
            3.2.1.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)
            3.2.1.4 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)
            3.2.1.5 PCR或酶切產(chǎn)物的回收純化
            3.2.1.6 目的片段與載體連接反應(yīng)
            3.2.1.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.1.8 重組質(zhì)粒的小量制備（OMEGA小提試劑盒）
            3.2.1.9 重組質(zhì)粒的大量制備（OMEGA去內(nèi)毒素大提試劑盒）
        3.2.2 定點(diǎn)突變技術(shù)改造質(zhì)粒
        3.2.3 細(xì)胞的傳代
        3.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.5 空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
            3.2.5.1 空斑前樣品處理
            3.2.5.2 空斑實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.6 間接免疫熒光檢測(cè)
            3.2.6.1 間接免疫熒光試驗(yàn)前樣品處理
            3.2.6.2 間接免疫熒光試驗(yàn)方法
        3.2.7 Western blotting檢測(cè)
            3.2.7.1 檢測(cè)樣品的準(zhǔn)備
            3.2.7.2 SDS-PAGE電泳
            3.2.7.3 Western blotting檢測(cè)
        3.2.8 JEV增殖及毒價(jià)測(cè)定
            3.2.8.1 JEV增殖及病毒分離
            3.2.8.2 JEV毒價(jià)的測(cè)定
            3.2.8.3 病毒神經(jīng)毒力,神經(jīng)侵襲力的測(cè)定
        3.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
            3.2.9.1 binding樣品處理
            3.2.9.2 RNA的提取
            3.2.9.3 RNA純度與濃度測(cè)定
            3.2.9.4 RNA的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程
            3.2.9.5 Quantitative RT-PCR檢測(cè)
        3.2.10 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
4 結(jié)果與分析
    4.1 JEV感染性克隆的構(gòu)建
        4.1.1 全長(zhǎng)質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒粒子的獲得
        4.1.2 全長(zhǎng)病毒粒子的鑒定
            4.1.2.1 RT-PCR鑒定
            4.1.2.2 Western blotting鑒定
            4.1.2.3 間接免疫熒光鑒定
            4.1.2.4 病毒空斑滴度及毒力的測(cè)定
            4.1.2.5 病毒一步法生長(zhǎng)曲線的繪制
            4.1.2.6 兩種病毒遺傳穩(wěn)定性的Western blotting檢測(cè)
    4.2 整合素αv/β3在JEV復(fù)制中功能研究
        4.2.1 αv和β3對(duì)JEV復(fù)制的影響
            4.2.1.1 αv和β3下調(diào)表達(dá)對(duì)JEV復(fù)制影響
            4.2.1.2 宿主細(xì)胞αv和β3蛋白封閉后對(duì)JEV復(fù)制影響
            4.2.1.3 CHO細(xì)胞上過(guò)表達(dá)β3對(duì)JEV增殖的影響
                4.2.1.3.1 JEV在CHO細(xì)胞上的增殖
                4.2.1.3.2 CHO細(xì)胞過(guò)表達(dá)β3后JEV感染情況的鑒定
        4.2.2 αv/β3影響JEV復(fù)制的機(jī)制初步研究
            4.2.2.1 αv/β3影響JEV增殖過(guò)程中的吸附階段
            4.2.2.2 RGD多肽對(duì)JEV復(fù)制的影響
            4.2.2.3 EDTA對(duì)JEV復(fù)制的影響
            4.2.2.4 αv/β3與JEV E蛋白相互作用
                4.2.2.4.1 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
                4.2.2.4.2 蛋白共定位試驗(yàn)
                4.2.2.4.3 Co-IP檢測(cè)蛋白相互作用
5 討論分析
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬乙型腦炎的診斷與科學(xué)防治[J]. 趙以云,王強(qiáng),左瑞華.  畜牧與飼料科學(xué). 2009(Z1)
[2]流行性乙型腦炎的流行病學(xué)[J]. 彭穎,余光開(kāi).  醫(yī)學(xué)綜述. 2007(02)
[3]ανβ3抗體對(duì)人肝癌細(xì)胞系MHCC97的黏附抑制作用[J]. 王艷紅,李立新,孫瑞霞,陳潔,劉銀坤,葉勝龍.  中華實(shí)驗(yàn)外科雜志. 2006(05)
[4]流行性乙型腦炎的流行和防治現(xiàn)狀──感染性疾病（3）[J]. 周伯平,陸堅(jiān).  新醫(yī)學(xué). 2004(10)

碩士論文
[1]豬源乙型腦炎病毒的分離鑒定及E基因假病毒的構(gòu)建[D]. 曹齊樹(shù).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[2]乙型腦炎病毒四川株的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[D]. 鄭文亞.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[3]水稻類整合素蛋白的免疫定位及其編碼基因的克隆與表達(dá)[D]. 張昌輪.揚(yáng)州大學(xué) 2010
[4]流行性乙型腦炎病毒NS1蛋白單克隆抗體的制備及病毒特異性抗原表位鑒定[D]. 王斌.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2009
[5]β3整合素作為漢坦病毒受體的鑒定以及其它候選受體的篩選[D]. 李青嶺.重慶醫(yī)科大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3081078