將外源多能轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）介導(dǎo)成體干細(xì)胞，誘導(dǎo)得到多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），其具有與ES （embryonic stem）細(xì)胞相同的特性，不涉及胚胎倫理問題。近年，iPSCs技術(shù)發(fā)展迅猛，成為生命科學(xué)研究及臨床應(yīng)用的熱點研究領(lǐng)域。國內(nèi)外多家實驗室成功地將豬體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs。但不同實驗室得到的豬iPSCs，由于采用的方法和培養(yǎng)條件不同，使其表觀遺傳特性存在差異。重編程過程需要高滴度的和一定化學(xué)劑量的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，誘導(dǎo)時4個轉(zhuǎn)錄因子隨機整合，形成的iPSCs通常擁有不同的拷貝數(shù)。這種病毒載體隨機拷貝插入和重編程的隨機性，給研究細(xì)胞重編程機制和利用小分子替代轉(zhuǎn)錄因子的研究帶來了困難。本實驗將攜帶4個鼠源多能轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體TetO-FUW-OSKM和輔助載體FUW-M2rtTA同時感染豬胎兒成纖維細(xì)胞（Porcine Embryonic Fibroblasts，PEF），將串聯(lián)的四因子整合到體細(xì)胞基因組中，在添加Dox （deoxycycline）的多能細(xì)胞培養(yǎng)條件下形成iPSCs，稱... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

復(fù)合型Tet-on系統(tǒng)示意圖

20321)和 FUW-M2rtTA(Plasmid 20342)來自于 addgene(圖3-1)。轉(zhuǎn)化：由于大腸桿菌 Stbl3 菌株具有能夠有效抑制長片段末端重復(fù)區(qū)的重組的可能性，Stbl3 菌株特別適合復(fù)制含有同向重復(fù)序列的慢病毒。按 GeneCopoeia 公司 E.colicompopetent cells stbl3(#U0103A)使用說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化。具體方法：(1) 將感受態(tài)細(xì)胞20

3.2.2 TetO 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的功能驗證FUW-M2rtTA F:ACTCGGTTTGTCGTCTGT 954 20342(來源于 Addgene)R:GCTACTTGATGCTCCTGTTmOct4F:AAGTTGGCGTGGA GACTTTG 479 NM_013633.3R:CATGGTCTCCAGACTCCACmSox2F:AGCCCGGACCGCGTCAAGA 610 NM_011443.3R:TGGAGCCCAGCGCCATACCGmKlf4F:TGGCTGCCAGCAACACAGGT 378 NM_010637.3R:TGACCGTGCAGGACGGGACCmc-MycF:AGGACTGTATGTGGAGCGGTTTC 490 AK087961.1R:AGTGGGCTGTGCGGAGGTTTR:CTTCTGGGTGGCAGTGAThGAPDH F: ACAACTTTGGTATCGTGGAA 458 NM_001256799.1R: AAATTCGTTGTCATACCAGG


本文編號：3074335