結(jié)核病是流行于世界各地、嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物健康的一類人畜共患傳染病。牛作為人類生產(chǎn)生活資料的重要來源,在結(jié)核病的傳播過程中有著重要地位。本研究對分離自寧夏和新疆為主的西北部分地區(qū)規(guī)�；膛鲋蠵PD陽性奶牛的疑似致病菌,采用多位點(diǎn)PCR進(jìn)行菌種鑒定。利用MIRU-VNTR基因分型技術(shù)探究牛源分離株的基因型。經(jīng)過藥物敏感試驗(yàn)了解牛源分離株的表型耐藥情況。通過對耐藥基因測序,研究耐藥菌株耐藥基因突變與表型耐藥和基因型之間的相關(guān)性。運(yùn)用基因測序技術(shù),探究西北五省非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacterium,NTM）的種類,為西北地區(qū)控制牛結(jié)核病提供可靠的理論依據(jù)。采用酸性羅氏無淀粉培養(yǎng)基對82株結(jié)核病疑似致病菌的凍存菌株進(jìn)行復(fù)壯和傳代培養(yǎng),最終成功復(fù)壯80株分離株。經(jīng)16SrRNA初步鑒定,80株臨床分離株均屬于分枝桿菌屬。通過MPT64基因和多位點(diǎn)PCR鑒定出30株MTBC,其中一株為寧夏株,其余29株分離株均為新疆株。采用比例法進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物（異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇）敏感試驗(yàn),20株（20/30,66.7%）結(jié)核分枝桿菌對四種一線抗結(jié)核藥均敏感,... 

【文章來源】：寧夏大學(xué)寧夏回族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２?１９９５－２０１７年全球范圍內(nèi)的肺結(jié)核耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)（ＷＨＯ?２０１７年報(bào)告）［３］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｇｌｏｂａｌ?ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ?ｄａｔａ?ｏｎ?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ?ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｄｕｒｉｎｇ?ｐｅｒｉｏｄ?１９９５－２０１７?（ＷＨＯ?２０１７?ｒｅｐｏｒｔ）?＾??１．１牛結(jié)核病流彳Ｔ特征研咒??根據(jù)報(bào)道，在全球范圍內(nèi)大約１５％結(jié)核病人是因?yàn)轱嬘媒Y(jié)核病牛生產(chǎn)的牛奶而受?

１．３．４?ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ?分型技術(shù)??ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ技術(shù)的基本原理就是基于同一位點(diǎn)的不同的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)，并且同一菌株中??不同位點(diǎn)的拷貝數(shù)不同對菌株進(jìn)行基因分型【６Ｓ】（如圖１－４）。該基因分型是在真核生物中常用的方??法，具有操作簡單、所需樣本量少、分辨力髙、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、結(jié)果易于數(shù)字化等優(yōu)點(diǎn)，便??于全球不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行結(jié)果比較［３７】，對于ＩＳ６１１０拷貝數(shù)很低的菌株也有很高的分型能力［６９］，是目??前最有前景的分型方法［７（Ｋ７２１。１９９７年，Ｓｕｐｐｌｙ等對ＢＣＧ和Ｍ?？ｗＺ）ｅｒｃｗ／ｏ＾ｓｅｎＸ３－ｒｅｇＸ３基因序列進(jìn)??行比較分析，證實(shí)不同結(jié)核分枝桿菌的基因組中都存在多個(gè)相似的重復(fù)序列［７３］。通過對Ｈ３７ＲＶ進(jìn)??行全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)了?４１個(gè)ＭＩＲＵ位點(diǎn)。通過設(shè)計(jì)特異性引物對４１個(gè)ＭＩＲＵ位點(diǎn)進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)??增再進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)其中的１２個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，因此可作為ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ基因分型的依據(jù)??［叫。??采用ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌臨床株進(jìn)行基因分型的過程中

ｐ、：＿＊；！??Ｉ?ｉｆｆ［??圖２－１結(jié)核分枝桿菌臨床分離株Ｌ－Ｊ培養(yǎng)結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｌ－Ｊ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｆ?ｃｌｉｎｉｃａｌ?ｉｓｏｌａｔｅｓ?ｏｆ?Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ??２．３．３?ＤＮＡ提取結(jié)果??經(jīng)ＮａｎｏＤｒｏｐ?８０００檢測提取的ＤＮＡ濃度和純度。經(jīng)過檢測，采用柱式分枝桿菌核酸提取試??劑盒提取的ＤＮＡ純度較高，濃度較低。采用雙蒸水或者ＴＥ緩沖液將提取的ＤＮＡ稀釋成合適的??工作濃度，并置于－２０°Ｃ冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩??２．３．４?ＰＣＲ鑒定結(jié)果??８０株臨床分離株均擴(kuò)增出陽性條帶（如圖２－２）。??圖２－２部分臨床分離株擴(kuò)增結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?１６ＳｒＲＮＡ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｏｍｅ?ｃｌｉｎｉｃａｌ?ｉｓｏｌａｔｅｓ??注：Ｍ：２０００ｂｐ?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１：陰性對照；２：陽性對照（標(biāo)準(zhǔn)株Ｈ３７Ｒｖ）；?３－１１：臨床分離株；１２：空白對照；目的片段：５４３ｂｐ??２．３．５?測序結(jié)果??將７沾測序結(jié)果在ＮＣＢＩ上進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對，一致性均為１００％，表明該８０株臨床分??離株均屬于分枝桿菌屬。??－１５－??


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