狂犬�。≧abies）是由狂犬病病毒感染引起的人畜共患病,臨床大多表現(xiàn)為特異性恐風(fēng)、恐水,咽肌痙攣、不可逆的腦脊髓炎等。盡管現(xiàn)在可以預(yù)防狂犬病,但我國(guó)狂犬病報(bào)告死亡數(shù)一直位居法定報(bào)告?zhèn)魅静∏傲�。目前狂犬病沒(méi)有有效的治療方法,一旦發(fā)病,這種疾病幾乎是致命的,對(duì)人的生命健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。近年來(lái)對(duì)狂犬病的研究取得了一些進(jìn)展,但對(duì)于狂犬病病毒感染發(fā)病機(jī)理的研究還不透徹。狂犬病病毒（Rabies Virus,RV）是一種嚴(yán)格的胞內(nèi)寄生病毒,病毒的整個(gè)生命周期需要多種宿主蛋白的參與。因此,探索與病毒生命周期相互作用的宿主蛋白并深入理解其作用機(jī)制,將有助于我們解釋病毒生命周期,為狂犬病的防治提供新的靶點(diǎn),為研究高效的口服疫苗奠定基礎(chǔ)。最近幾年興起的基于CRISPR技術(shù)高通量篩選技術(shù)幾乎能夠?qū)Σ《旧芷诘乃蟹矫孢M(jìn)行系統(tǒng)的研究,可快速尋找參與病毒侵入、復(fù)制等生物學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵宿主蛋白。所以,CRISPR/Cas9技術(shù)將會(huì)為狂犬病病毒生命周期的進(jìn)一步探索,靶向藥物的設(shè)計(jì)及治療提供有力的技術(shù)支持。本研究通過(guò)使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法在鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞（N2a）細(xì)胞上構(gòu)建表達(dá)Cas9蛋白的N2a-Cas9單克隆細(xì)胞... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas系統(tǒng)的階段

CRISPR/Cas9的應(yīng)用(STERNBERGandDOUDNA,2015)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論7圖1-3CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選模型及類(lèi)型(SOetal.,2019)Fig.1-3CRISPR-Cas9functionalgenomicsscreenmodelandthetype(SOetal.,2019)1.3.2CRISPR/Cas9高通量篩選技術(shù)流程CRISPR作為一種新的篩選技術(shù)，陣列篩選與混合篩選是CRISPR/Cas9文庫(kù)篩選常用的表現(xiàn)形式。陣列篩選在多孔板上操作，每孔包含一個(gè)獨(dú)特的已知的sgRNA，可以檢測(cè)多種細(xì)胞表型，但是這種方式需要較高的費(fèi)用并且耗時(shí)長(zhǎng)，不具有實(shí)用性，混合篩選被廣泛使用中。在混合篩選中，慢病毒sgRNAs混合在一起，同時(shí)以低MOI大規(guī)模轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞。為了減少sgRNA損失，CRISPR/Cas9功能基因篩選通過(guò)為每個(gè)sgRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到平均500-1000個(gè)細(xì)胞，以保持完整的sgRNA文庫(kù)覆蓋率(DOENCHetal.,2016)。然后，通過(guò)利用一種生存/死亡表型或通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選儀(florescence-activatedcellsorting,FACS)來(lái)分離帶標(biāo)記的細(xì)胞。由于每個(gè)sgRNA的兩側(cè)都具有相同的序列（例如，5"端的U6啟動(dòng)子和在3"端sgRNA的支架序列），整合到所選細(xì)胞集落的基因組


本文編號(hào)：3060724