豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是豬流行性腹瀉病（porcine epidemic diarrhea, PED）的病原,屬于冠狀病毒科,為有囊膜,單股正鏈RNA病毒。該病是一種急性、高度接觸性的傳染病,以嚴重腸炎、嘔吐和水樣腹瀉為特征,對我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。2010-2012年,PED在免疫豬場的再次爆發(fā)說明我國流行毒株可能發(fā)生了變異,導(dǎo)致疫苗免疫效果下降,因此對我國流行毒株進行系統(tǒng)進化分析,比較疫苗株與野毒株之間的差異,有利于更具保護力的新型疫苗的開發(fā)。首先,建立了PEDV的實時熒光定量PCR檢測方法并應(yīng)用于PEDV細胞培養(yǎng)物中病毒拷貝數(shù)的檢測。根據(jù)PEDV M基因保守序列設(shè)計合成一對引物和探針,通過反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化,成功建立了TaqMan實時熒光定量PCR （FQ-PCR）檢測方法,該方法具有特異、靈敏、快速等優(yōu)點,在101-109拷貝/u1之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)達到0.99以上,擴增效率在90%-110%之間。其次,本研究根據(jù)GenBank上登錄的PEDV參考株CV777（AF353511... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
上篇 豬流行性腹瀉研究進展
    1 豬流行性腹瀉的歷史背景
    2 病原學(xué)
        2.1 病毒的形態(tài)
        2.2 分類地位
        2.3 理化特性
        2.4 細胞培養(yǎng)特性
        2.5 病毒基因組及其編碼蛋白
    3 流行病學(xué)
    4 診斷方法
        4.1 RT-PCR診斷方法
        4.2 免疫電鏡
        4.3 免疫熒光
        4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗
        4.5 實時熒光定量PCR
    5 PED的治療
    6 PED的預(yù)防
        6.1 PEDV滅活苗
        6.2 PEDV弱毒苗
    參考文獻
下篇 試驗研究
    第一章 PEDV熒光定量檢測方法的建立及JS2008毒株在VERO細胞中的定量檢測
        摘要
        Abstract
        1 材料與方法
            1.1 菌株、毒株及病料
            1.2 主要試劑和儀器
            1.3 引物和探針的設(shè)計及合成
            1.4 重組質(zhì)粒標準品的制備
            1.5 FQ-PCR檢測方法的建立
        2 結(jié)果與分析
            2.1 質(zhì)粒標準品的制備
            2.2 FQ-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
            2.3 FQ-PCR標準曲線的建立
            2.4 FQ-PCR的敏感性分析
            2.5 FQ-PCR的重復(fù)性分析
            2.6 FQ-PCR的特異性分析
            2.7 細胞培養(yǎng)物中PEDV的定量檢測
        3 討論
        參考文獻
    第二章 PEDV全基因組測序及序列分析
        摘要
        Abstact
        1 材料與方法
            1.1 細胞和毒株
            1.2 樣品
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器設(shè)備
            1.5 引物
            1.6 RNA的提取
            1.7 反轉(zhuǎn)錄
            1.8 PCR
            1.9 PCR產(chǎn)物鑒定及純化回收
            1.10 PCR產(chǎn)物連接與轉(zhuǎn)化
            1.11 重組質(zhì)粒提取、鑒定及序列測定
            1.12 全基因組序列確定、分析和比較
            1.13 參考序列
        2 結(jié)果
            2.1 JS2008、AH2012、JS-HZ2012和SX2012毒株的基因組結(jié)構(gòu)及分析
            2.2 S基因序列分析
            2.3 ORF3進化分析
            2.4 E基因序列分析
            2.5 M基因序列分析
            2.6 N基因進化分析
        3 討論
        參考文獻
全文結(jié)論
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]TaqMan熒光定量PCR檢測豬流行性腹瀉病毒方法的建立與初步應(yīng)用[J]. 劉鄧,袁秀芳,冉多良,徐麗華,牛登元,王朝文,王一成.  中國動物傳染病學(xué)報. 2010(01)
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本文編號：3059387