小反芻獸疫病毒血凝素蛋白與綿羊CD46蛋白相互作用的初探
發(fā)布時間：2021-02-19 14:30
近年來PPRV跨地區(qū)、跨國界的傳播,對全球防控PPR提出了嚴峻挑戰(zhàn)。開展PPRV細胞受體的研究有助于探究PPRV的致病機理,對于該病的防控具有指導意義。與PPRV同屬的人的病毒麻疹病毒受體的相關研究已經(jīng)很深入,從文獻了解到人的麻疹病毒的受體分別為CD46、Slam、Nectin4這三種。目前,已經(jīng)證實PPRV與MV一樣利用SLAM作為受體開啟病毒的入侵,本論文旨在闡明CD46分子是否也做為PPRV的受體,開展了如下工作：1.采用3’/5’RACE方法從綿羊外周血淋巴細胞中首次克隆該基因,測序結果顯示綿羊CD46含有七種不同的可變剪切形式。構建重組表達載體pCMV-Myc/CD46并在CHO-K1細胞中高效表達,經(jīng)、Vestern blotting分析CD46蛋白表達良好,片段大小與預期符合。2.取編號CD46a基因進行常規(guī)生物信息學分析。結果表明,綿羊CD46a的cDNA序列開放閱讀框長1083bp,編碼由360個氨基酸殘基組成的多肽,該多肽分子質量理論值為39ku,理論等電點為6.5。對該蛋白結構分析發(fā)現(xiàn)綿羊CD46a第1-42位氨基酸殘基為信號肽序列共有5處N糖基化位點,4處蛋白激...
【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：72 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
小反自獸疫病毒基因組結構圖
中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第二章綿羊CD46基因的克隆與表達收集該層細胞，沉淀經(jīng)反復洗2次即得所需淋巴細胞.然后加TRIzol試劑，按照TRIzoH?式劑盒說明書抽提細胞總RNA。RNA提取過程中加入DNA酶消化處理，使用紫外分光光度計NanoDrop 2000測定RNA的A280和A260以計算總RNA的濃度，將其放入-80°C備用。2.2.2綿羊CD46基因的f廣增根據(jù)GenBank中收錄的綿羊CD46基因的兩條部分序列預測信息（XMJ)04013924.1，XM_004013923.1),與人的CD46進行序列比對搜索到保守序列設計2條引物（分別命名為CD46UP,CD46DN),以提取的綿羊總RNA為模板擴增該保守序列。獲得的序列經(jīng)NCBI Blast證實其為綿羊CD46部分序列。然后根據(jù)擴增獲得的綿羊的CD46基因部分序列，設計5 'RACE和3’RACE需要的特異性引物GSP1和GSP2，巢式PCR鑒定引物NGSP1和NGSP2;將375’RACE片段及上述獲得的CD46部分序列拼接得到全長基因，然后根據(jù)該基因序列設計擴增綿羊CD46完整cDNA片段的引物CD46~cDNA-F和CD46~cDNA-R,引物設計策略如圖2.1所示，引物序列見表2.1。
擴增片段均與己知CD46序列有重疊區(qū)域，經(jīng)blast和序列拼接分析得到全長基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)lOg/L瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶大小與預期擴增片段基本一致，約為1500bp (見圖2.2)，經(jīng)測序證實為綿羊的CD46基因。M 1lOOObp 資露5 ■ +〒::. ■‘ 1750bp『^SOObp ‘ ‘ “ 1250bploobp r ’ ^ 4圖2.2綿羊CD46基因的RT-PCR丨廣增MDL2000Marker; 1 .PCR 產(chǎn)物。Fi^.2 RT-PCR amplification of CD46 gene of sheepMDL2000Marker; I. PCR product.2.3.2綿羊CD46基因序列分析pGEM-T easy載體的測序結果顯示，綿羊CD46基因存在七種可變剪切形式，將其命名為CD46a-g,使用ORF Finder找到CD46的7個剪切體的幵放閱讀框序列。2.3.3 pCMV/Myc/CD46a-g重組表達載體的構建與鑒定將CD46a-g擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI、Kpn I雙酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的載體進行連接，構建重組表達載體。構建的重組質粒經(jīng)雙酶切后，出現(xiàn)大小與目的片段相一致的特異條帶（見圖2.3)，說明重組表達載體構建成功。經(jīng)測序鑒定，CD46a-g七個不同剪切形式的ORF成功插入到表達載體pCMV/Myc中
【參考文獻】：
期刊論文
[1]表達小反芻獸疫H蛋白的重組山羊痘病毒疫苗[J]. 陳偉業(yè),曲林茂,胡森,胡倩倩,張倩,支海兵,黃克和,步志高. 生物工程學報. 2009(04)
[2]我國西藏小反芻獸疫病毒China/Tib/Gej/07-30核衣殼蛋白基因和基因組啟動子區(qū)的分子特征分析[J]. 包靜月,王志亮,李林,趙文姬,索朗次仁,李金明,王英麗,吳曉東,劉春菊,劉雨田,于小靜,楊詠梅. 病毒學報. 2008(06)
博士論文
[1]小反芻獸疫病毒樣顆粒的裝配與釋放研究[D]. 王秋霞.中國農業(yè)科學院 2013
[2]小反芻獸疫病毒全長cDNA的構建及DNA疫苗的免疫學研究[D]. 翟軍軍.中國農業(yè)科學院 2012
本文編號：3041251
【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：72 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
小反自獸疫病毒基因組結構圖
中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第二章綿羊CD46基因的克隆與表達收集該層細胞，沉淀經(jīng)反復洗2次即得所需淋巴細胞.然后加TRIzol試劑，按照TRIzoH?式劑盒說明書抽提細胞總RNA。RNA提取過程中加入DNA酶消化處理，使用紫外分光光度計NanoDrop 2000測定RNA的A280和A260以計算總RNA的濃度，將其放入-80°C備用。2.2.2綿羊CD46基因的f廣增根據(jù)GenBank中收錄的綿羊CD46基因的兩條部分序列預測信息（XMJ)04013924.1，XM_004013923.1),與人的CD46進行序列比對搜索到保守序列設計2條引物（分別命名為CD46UP,CD46DN),以提取的綿羊總RNA為模板擴增該保守序列。獲得的序列經(jīng)NCBI Blast證實其為綿羊CD46部分序列。然后根據(jù)擴增獲得的綿羊的CD46基因部分序列，設計5 'RACE和3’RACE需要的特異性引物GSP1和GSP2，巢式PCR鑒定引物NGSP1和NGSP2;將375’RACE片段及上述獲得的CD46部分序列拼接得到全長基因，然后根據(jù)該基因序列設計擴增綿羊CD46完整cDNA片段的引物CD46~cDNA-F和CD46~cDNA-R,引物設計策略如圖2.1所示，引物序列見表2.1。
擴增片段均與己知CD46序列有重疊區(qū)域，經(jīng)blast和序列拼接分析得到全長基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)lOg/L瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶大小與預期擴增片段基本一致，約為1500bp (見圖2.2)，經(jīng)測序證實為綿羊的CD46基因。M 1lOOObp 資露5 ■ +〒::. ■‘ 1750bp『^SOObp ‘ ‘ “ 1250bploobp r ’ ^ 4圖2.2綿羊CD46基因的RT-PCR丨廣增MDL2000Marker; 1 .PCR 產(chǎn)物。Fi^.2 RT-PCR amplification of CD46 gene of sheepMDL2000Marker; I. PCR product.2.3.2綿羊CD46基因序列分析pGEM-T easy載體的測序結果顯示，綿羊CD46基因存在七種可變剪切形式，將其命名為CD46a-g,使用ORF Finder找到CD46的7個剪切體的幵放閱讀框序列。2.3.3 pCMV/Myc/CD46a-g重組表達載體的構建與鑒定將CD46a-g擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI、Kpn I雙酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的載體進行連接，構建重組表達載體。構建的重組質粒經(jīng)雙酶切后，出現(xiàn)大小與目的片段相一致的特異條帶（見圖2.3)，說明重組表達載體構建成功。經(jīng)測序鑒定，CD46a-g七個不同剪切形式的ORF成功插入到表達載體pCMV/Myc中
【參考文獻】：
期刊論文
[1]表達小反芻獸疫H蛋白的重組山羊痘病毒疫苗[J]. 陳偉業(yè),曲林茂,胡森,胡倩倩,張倩,支海兵,黃克和,步志高. 生物工程學報. 2009(04)
[2]我國西藏小反芻獸疫病毒China/Tib/Gej/07-30核衣殼蛋白基因和基因組啟動子區(qū)的分子特征分析[J]. 包靜月,王志亮,李林,趙文姬,索朗次仁,李金明,王英麗,吳曉東,劉春菊,劉雨田,于小靜,楊詠梅. 病毒學報. 2008(06)
博士論文
[1]小反芻獸疫病毒樣顆粒的裝配與釋放研究[D]. 王秋霞.中國農業(yè)科學院 2013
[2]小反芻獸疫病毒全長cDNA的構建及DNA疫苗的免疫學研究[D]. 翟軍軍.中國農業(yè)科學院 2012
本文編號：3041251
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