背景：Myostatin基因?yàn)榧∪馍L(zhǎng)抑素基因,又稱為生長(zhǎng)／分化因子8（GDF8）,它屬于TGF-β超家族的成員之一,該基因與肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān),是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。在哺乳動(dòng)物中,自然突變或者人工突變引起的myostatin基因失活都可以引發(fā)骨骼肌數(shù)量的增加,增加家畜產(chǎn)瘦肉的能力,從而提高家畜的生產(chǎn)性能,其為提高家畜生產(chǎn)效率的研究開辟了一條新的途徑。人工敲除myostatin基因的方法有同源重組打靶、RNAi干擾和人工設(shè)計(jì)核酸酶切割三種方法,但同源重組打靶效率低、耗時(shí)長(zhǎng)；攜帶siRNA的病毒載體隨機(jī)插入引起機(jī)體功能紊亂的風(fēng)險(xiǎn)較高；而且以上兩種方法都將向動(dòng)物基因組中引入外源基因；人工設(shè)計(jì)核酸酶進(jìn)行基因敲除不僅效率較高且極大的降低了引入外源基因的風(fēng)險(xiǎn)。人工設(shè)計(jì)核酸酶由可以識(shí)別并結(jié)合特定DNA序列的鋅指蛋白和對(duì)DNA序列進(jìn)行非特異切割的Fok I核酸酶組成,其對(duì)基因組進(jìn)行切割時(shí)會(huì)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB）, DSB主要由細(xì)胞胞內(nèi)兩種修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)----同源修復(fù)（HDR）和非同源末端連接（NHEJ）,尤其是NHEJ在修復(fù)過程中往往會(huì)造成小片段的插入和缺失,造成遺傳信息的丟失,從而... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：130 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語的中英文對(duì)照
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 肌肉生長(zhǎng)抑制素（MYOSTATIN）基因的研究進(jìn)展
        1. MSTN基因的起源
        2. MSTN基因的結(jié)構(gòu)
        3. MSTN基因的表達(dá)規(guī)律
        4. MSTN的生物學(xué)功能及其應(yīng)用
            4.1 與肌肉組織的關(guān)系
            4.2 與脂肪組織的關(guān)系
            4.3 與其它組織的關(guān)系
        5. 結(jié)論
    第二章 鋅指核酸酶在基因打靶中的應(yīng)用
        1. 鋅指核酸酶
            1.1 鋅指蛋白
            1.2 FOKI切割域
        2. ZFNS介導(dǎo)基因敲除和插入
            2.1 DNA雙鏈斷裂的產(chǎn)生
            2.2 基因破壞
            2.3 依賴于同源性的基因組修飾
        3. 基因組修飾的特異性
            3.1 ZFNs系統(tǒng)的優(yōu)化
            3.2 檢測(cè)ZFNs的特異性
        4. ZFNS在治療上的應(yīng)用
            4.1 ZFNs在疾病治療中的進(jìn)展
            4.2 ZFNs治療存在脫靶的問題
        5. 結(jié)論
    第三章 高效的基因組修飾工具-----TALEN
        1. TALES：新的DNA結(jié)合域
        2. TALENS對(duì)基因組的修飾
        3. TALENS的特異性及脫靶研究
        4. 結(jié)論
第二部分 實(shí)驗(yàn)研究
    第四章 ZFNS介導(dǎo)豬MYOSTATIN基因定點(diǎn)敲除的研究
        1 材料與儀器
            1.1 質(zhì)粒及試劑
            1.2 主要儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 靶向豬MYOSTATIN基因ZFNs的鑒定和體外轉(zhuǎn)錄
            2.2 注射編碼ZFN蛋白的MRNA對(duì)豬孤雌胚發(fā)育的影響
            2.3 ZFN在豬卵母細(xì)胞中介導(dǎo)的MYOSTATIN基因敲除的研究
            2.4 ZFN在豬胎兒成纖維細(xì)胞中介導(dǎo)MYOSTATIN基因敲除的研究
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 靶向豬MYOSTATIN基因的ZFN設(shè)計(jì)
            3.2 靶向MYOSTATIN基因的ZFNs活性驗(yàn)證
            3.3 ZFNs表達(dá)載體的鑒定及MRNA的體外轉(zhuǎn)錄
            3.4 注射MRNA對(duì)豬孤雌胚發(fā)育的影響
            3.5 MYOSTATIN基因突變檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)
            3.6 ZFNs介導(dǎo)的孤雌胚胎中MYOSTATIN基因突變的檢測(cè)
            3.7 孤雌胚胎中MYOSTATIN基因的突變驗(yàn)證
            3.8 用T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ進(jìn)行突變體的檢測(cè)
            3.9 TA克隆測(cè)序檢測(cè)
            3.10 ZFNs注射的豬孤雌胚胎的數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)
            3.11 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的對(duì)比
            3.12 ZFN蛋白的細(xì)胞定位
            3.13 ZFNs處理的PEF細(xì)胞中MYOSTATIN基因突變檢測(cè)
            3.14 ZFN處理細(xì)胞的DNA序列分析
        4 討論
            4.1 ZFNs的設(shè)計(jì)和傳遞形式
            4.2 卵母細(xì)胞的發(fā)育以及注射MRNA對(duì)豬孤雌胚發(fā)育的影響
            4.3 ZFNs在豬卵母細(xì)胞中介導(dǎo)的基因敲除
            4.4 ZFNS在PEF細(xì)胞中介導(dǎo)的MYOSTATIN基因的敲除
    第五章 TALENS介導(dǎo)豬MYOSTATIN基因定點(diǎn)敲除的研究
        1 材料與儀器
            1.1 質(zhì)粒及試劑
            1.2 主要儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 靶向豬MYOSTATIN基因TALENs的鑒定和體外轉(zhuǎn)錄
            2.2 豬胎兒成纖維細(xì)胞中TALENS的轉(zhuǎn)染與效果檢測(cè)
            2.3 豬孤雌激活胚的MRNA注射
            2.4 豬孤雌胚胎中TALENS注射的效果檢測(cè)
        3 結(jié)果分析
            3.1 靶向豬MYOSTATIN基因TALEN的設(shè)計(jì)
            3.2 TALENs表達(dá)載體的鑒定及MRNA的體外轉(zhuǎn)錄
            3.3 TALENs蛋白的細(xì)胞定位
            3.4 TALENs處理的豬胎兒成纖維細(xì)胞中MYOSTATIN基因突變檢測(cè)
            3.5 TALENs處理細(xì)胞的MYOSTATIN基因的TA克隆測(cè)序分析
            3.6 TALENs注射的豬孤雌胚胎中MYOSTATIN基因的突變檢測(cè)
            3.7 TALENs處理的豬孤雌胚胎MYOSTATIN基因的TA克隆測(cè)序分析
        4 討論
            4.1 TALEN的設(shè)計(jì)
            4.2 不同條件下TALEN的切割效率
            4.3 不同條件下突變的檢測(cè)效率
            4.4 TALEN與ZFN在細(xì)胞和胚胎水平上切割活性的比較
全文結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
附錄
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]保存卵巢生理鹽水溫度的下降對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J]. 蔡元,張兆旺,田見暉,成文敏,王金勇.  中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘. 2006(01)
[3]豬卵母細(xì)胞體外成熟和孤雌激活效率影響因素分析[J]. 邢鳳英,吳中紅,曾申明,劉國(guó)世,朱士恩,張忠誠(chéng),陳學(xué)進(jìn).  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2004(01)
[4]培養(yǎng)過程中溫度對(duì)豬卵母細(xì)胞發(fā)育的影響(脂滴部分)[J]. 姜國(guó)誠(chéng),秦鵬春.  東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào). 1990(01)



本文編號(hào)：3038145