本項(xiàng)目應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)新技術(shù)，在成功建立針對(duì)PCV2基因保守序列檢測(cè)的PCR、熒光定量PCR和LAMP方法，并在對(duì)各檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化和比較的基礎(chǔ)上，結(jié)合免疫學(xué)和傳統(tǒng)病理學(xué)檢測(cè)等手段，對(duì)遼寧省豬群PCV2感染進(jìn)行了較全面系統(tǒng)的調(diào)查和研究，主要結(jié)果如下：一、參照GenBank中PCV2全基因序列，針對(duì)PCV2基因保守序列建立了分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，包括普通PCR、熒光定量PCR和LAMP方法，并對(duì)其條件進(jìn)行優(yōu)化和比較。1.普通PCR方法反應(yīng)體系中引物最佳濃度為0.4μmol/L，最佳退火溫度為53℃，靈敏度為2853拷貝/μL PCV2基因組DNA，可在4h內(nèi)完成對(duì)樣品的檢測(cè)。2.熒光定量PCR方法引物和探針最佳濃度分別為0.5μmol/L和0.6μmol/L，可檢測(cè)的極限拷貝量為15拷貝/μL，較普通PCR方法靈敏度高出190倍；繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（k）為-3.004973，截距為6.631623，其相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999212，表明該套引物和探針檢測(cè)效率極高；模板濃度在1.50×103～108拷貝/μL范圍內(nèi)，具有良好的重復(fù)性。3. LAMP方法靈敏度達(dá)1.4拷貝/μL，較熒光定... 

【文章來(lái)源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：135 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 豬圓環(huán)病毒病研究進(jìn)展
        1.1.1 病原學(xué)
        1.1.2 PCV2 致病機(jī)制
        1.1.3 PCV 流行病學(xué)
        1.1.4 PCVD 的診斷
        1.1.5 PCV2 疫苗研究進(jìn)展
        1.1.6 PCVD 防制
    1.2 本研究的目的與意義
2 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 病毒
        2.1.2 細(xì)胞和菌種
        2.1.3 主要生物制劑和化學(xué)試劑
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 PCV2 PCR 檢測(cè)方法的建立
        2.2.2 PCV2 實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)方法的建立
        2.2.3 PCV2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法的建立
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        2.2.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法
    2.3 數(shù)據(jù)處理
3 結(jié)果與分析
    3.1 PCV2 PCR 檢測(cè)方法的建立
        3.1.1 PCR 體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.1.2 特異性試驗(yàn)
        3.1.3 敏感性試驗(yàn)
        3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)
    3.2 PCV2 熒光 PCR 檢測(cè)方法的建立
        3.2.1 目的片段的擴(kuò)增、序列測(cè)定及其分析
        3.2.2 熒光 PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化
        3.2.3 特異性試驗(yàn)
        3.2.4 敏感性試驗(yàn)
        3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
        3.2.6 重復(fù)性檢驗(yàn)
    3.3 PCV2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法的建立
        3.3.1 LAMP 引物的初步篩選
        3.3.2 LAMP 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.3.3 LAMP 特異性試驗(yàn)
        3.3.4 LAMP 敏感性試驗(yàn)
        3.3.5 LAMP 重復(fù)性試驗(yàn)
        3.3.6 PCV2 LAMP 檢測(cè)方法的可視化
        3.3.7 LAMP 方法與其他檢測(cè)方法符合率的比較
    3.4 遼寧地區(qū)規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)豬群 PCV2 流行情況
        3.4.1 不同養(yǎng)殖規(guī)模豬群 PCVD 臨診發(fā)病情況調(diào)查
        3.4.2 PCV2 感染豬血清學(xué)調(diào)查
    3.5 遼寧地區(qū)豬群 PCV2 病原學(xué)監(jiān)測(cè)
        3.5.1 患病豬群組織樣品 PCV2 核酸檢測(cè)
        3.5.2 假定健康豬群病原學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果
    3.6 PCV2 與豬其他主要病毒性疫病混合感染情況
    3.7 遼寧地區(qū) PCV2 分子流行病學(xué)研究
        3.7.1 不同基因型 PCV2 在遼寧豬群中的流行情況
        3.7.2 PCV2 全基因組的擴(kuò)增與序列測(cè)定
        3.7.3 PCV2 全基因組序列分析
        3.7.4 ORF1 及其推導(dǎo)氨基酸序列分析
        3.7.5 ORF2 及其推導(dǎo)氨基酸序列分析
    3.8 PCV2 在豬體內(nèi)、外的動(dòng)力學(xué)研究
        3.8.1 PCV2 感染對(duì)仔豬 PRRSV、CSFV 和 PRV 疫苗免疫應(yīng)答的影響
        3.8.2 假定健康豬群 PCV2 核酸陽(yáng)性率與 PRRSV 核酸陽(yáng)性率相關(guān)性分析
        3.8.3 患病豬群中 PCV2、PRRSV 及 CSFV 陽(yáng)性率間的關(guān)系
        3.8.4 PCV2 陽(yáng)性臨診健康和 PMWS 豬主要臨診表現(xiàn)及眼觀病理變化
        3.8.5 PCV2 陽(yáng)性臨診健康和 PMWS 豬血液、分泌物和排泄物中 PCV2 的檢測(cè)
        3.8.6 PCV2 陽(yáng)性臨診健康和 PMWS 豬主要組織臟器中 PCV2 的檢測(cè)
4 討論
    4.1 PCV2 分子診斷技術(shù)的建立及其應(yīng)用
    4.2 遼寧省規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng) PCVD 流行情況及其分析
        4.2.1 遼寧省規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng) PCVD 臨診發(fā)病情況
        4.2.2 PCV2 血清學(xué)調(diào)查及分析
        4.2.3 豬群 PCV2 病原學(xué)監(jiān)測(cè)及與豬其他主要病毒性疫病混合感染情況
    4.3 遼寧省 PCV2 分子流行病學(xué)研究
        4.3.1 不同基因型 PCV2 在遼寧省豬群中的流行情況
        4.3.2 41 株遼寧 PCV2 毒株遺傳演化分析
        4.3.3 41 株遼寧 PCV2 毒株與國(guó)內(nèi)、外毒株比較分析
    4.4 PCV2 在豬體內(nèi)、外的動(dòng)力學(xué)研究
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3026895