山羊細菌性和病毒性疾病對羊群的危害嚴重，對于這些疾病的治療，目前還沒有特效藥。IFN-γ作為一種多效應(yīng)細胞因子，具有抵抗細菌或是病毒對宿主細胞的入侵，對腫瘤免疫監(jiān)視，免疫調(diào)節(jié)等作用。IFN-γ的原核表達產(chǎn)物已被應(yīng)用于人和動物臨床疾病治療中，本研究開展山羊IFN-γ的克隆表達及抗病毒活性研究，以期為山羊重要疫病的臨床治療提供新的手段。本研究根據(jù)Genbank中發(fā)布的山羊IFN-γmRNA序列設(shè)計引物。分離山羊外周血淋巴細胞，刺激培養(yǎng)后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，經(jīng)PCR擴增后得到山羊IFN-γCDs區(qū)基因，并構(gòu)建克隆載體。經(jīng)測序鑒定后，設(shè)計表達引物，PCR擴增得到去掉信號肽的IFN-γ基因，構(gòu)建表達載體，測序鑒定后進行誘導(dǎo)表達，將原核表達產(chǎn)物純化后免疫家兔制抗體，并測定原核表達蛋白的生物活性。獲得以下結(jié)果：1．測序結(jié)果表明克隆得到的序列為山羊IFN-γ，與GenBank中公布的其他山羊IFN-γ基因序列相似性均在99%以上。其序列長度為501bp，前69bp編碼信號肽序列，后面432bp編碼142個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約15.9ku，蛋白質(zhì)序列中含有2個潛在N糖基化位點。2．重組... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
綜述部分
    第一章 IFN-γ研究進展
        1.1 前言
        1.2 IFN-γ的分子生物學(xué)研究進展
            1.2.1 IFN-γ結(jié)構(gòu)
            1.2.2 IFN-γ受體
            1.2.3 IFN-γ的作用機制
        1.3 干擾素的理化性質(zhì)及免疫學(xué)活性
            1.3.1 干擾素的理化性質(zhì)
            1.3.2 干擾素的免疫學(xué)活性
        1.4 干擾素的獸醫(yī)臨床應(yīng)用
            1.4.1 干擾素應(yīng)用于病毒病的治療
            1.4.2 干擾素應(yīng)用于細菌性疾病的治療
            1.4.3 IFN-γ的其他應(yīng)用
        1.5 山羊 IFN-γ研究進展
試驗研究
    第二章 山羊 IFN-γ基因的克隆及序列分析
        2.1 材料
            2.1.1 實驗動物
            2.1.2 菌株及載體
            2.1.3 主要試劑
            2.1.4 主要儀器
            2.1.5 主要溶液配方
        2.2 方法
            2.2.1 引物設(shè)計
            2.2.2 山羊外周血淋巴細胞分離培養(yǎng)
            2.2.3 淋巴細胞總 RNA 提取
            2.2.4 cDNA 的合成和 PCR 擴增
            2.2.5 克隆載體構(gòu)建
            2.2.6 目的基因序列分析
        2.3 結(jié)果與分析
            2.3.1 目的基因 RT-PCR 擴增結(jié)果
            2.3.2 重組質(zhì)粒 PCR 鑒定結(jié)果
            2.3.3 克隆質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果
            2.3.4 測序結(jié)果分析及 IFN-γ序列分析
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 山羊 IFN-γ基因原核表達
        3.1 材料
            3.1.1 菌種和載體
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 主要儀器
            3.1.4 主要溶液配方
        3.2 方法
            3.2.1 引物設(shè)計
            3.2.2 目的片段克隆
            3.2.3 原核表達載體的構(gòu)建
            3.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及 Western-blot 檢測
            3.2.5 重組蛋白純化
            3.2.6 多克隆抗體制備
            3.2.7 抗山羊 IFN-γ多抗效價的 ELISA 測定
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 目的基因 PCR 結(jié)果
            3.3.2 IFN-γ重組質(zhì)粒 PCR 結(jié)果
            3.3.3 IFN-γ重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果
            3.3.4 蛋白表達誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果
            3.3.5 重組蛋白 Western-blot 分析結(jié)果
            3.3.6 重組蛋白純化結(jié)果
            3.3.7 兔抗重組山羊 IFN-γ蛋白多克隆抗體效價測定
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 重組山羊 IFN-γ抗 ORFV 活性鑒定
        4.1 材料
            4.1.1 試驗動物、細胞及毒株
            4.1.2 主要試劑
            4.1.3 主要儀器
            4.1.4 主要試劑配方
        4.2 方法
            4.2.1 IFN-γ抗 ORFV 在山羊胎兒成纖維細胞上的增殖
            4.2.2 ORFV 毒價測定
            4.2.3 ORFV DNA 的提取
            4.2.4 ORFV DNA 的 Q-PCR 反應(yīng)及標準曲線的建立
            4.2.5 重組 IFN-γ抗 ORFV 試驗
            4.2.6 數(shù)據(jù)分析
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 ORFV 毒價測定
            4.3.2 標準曲線建立結(jié)果
            4.3.3 重組 IFN-γ抗 ORFV 增殖結(jié)果
            4.3.4 重組 IFN-γ抗 ORFV 效價測定結(jié)果
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
縮略詞
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]羊口瘡抗體ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 李杰.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013
[2]羊口瘡疫苗研制及其免疫效果評估[D]. 田婷婷.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013



本文編號：3020745