綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae.MO）是一種高度接觸性傳染病,在世界上流行范圍極大,可以造成綿羊和山羊的傳染性胸膜肺炎。由于支原體生物結(jié)構(gòu)上的特殊性,導(dǎo)致大部分的抗生素類藥物對其無效。因為支原體的人工培養(yǎng)難度較大,生長周期長,從而使其在傳統(tǒng)疫苗研究工作上也進展緩慢。隨著生物化學(xué)和生物工程信息技術(shù)的發(fā)展,人們開始著重于研究新型的疫苗。本實驗從綿羊肺炎支原體的全基因組開始,通過綿羊肺炎支原體培養(yǎng)過程中的溶血現(xiàn)象。來進行溶血素蛋白基因的克隆,并且通過原核表達來研究其蛋白的活性。首先在基因片段的克隆上,由于TGA在大腸桿菌的表達系統(tǒng)中為終止密碼子,通過定點突變的方法將綿羊肺炎支原體的溶血素（hemolysin）基因上面的TGA突變?yōu)門GG,使克隆后的基因片段在大腸桿菌的表達系統(tǒng)中與在支原體的表達系統(tǒng)中相一致。將克隆好的基因片段與PET32a質(zhì)粒進行連接,并轉(zhuǎn)入可以大量表達蛋白的大腸桿菌感受態(tài)細胞中。經(jīng)過對誘導(dǎo)條件的研究,經(jīng)過SDS-PAGE電泳實驗證明,可以表達出正確的目的蛋白,其大小為44.5kDa,將經(jīng)過純化的蛋白進行western blot實驗,結(jié)果證明... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：48 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
插圖和附表清單
縮略語表
1. 引言
    1.1 綿羊肺炎支原體的概述
        1.1.1 病原學(xué)
        1.1.2 流行病學(xué)
        1.1.3 致病機理
        1.1.4 臨床癥狀和病理變化
    1.2 綿羊肺炎支原體的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 免疫活性與疫苗的研究進展
        1.2.2 綿羊肺炎基因組的研究進展
    1.3 本實驗的研究目的和意義以及實驗思路
        1.3.1 實驗?zāi)康暮鸵饬x
        1.3.2 實驗思路
2. 綿羊肺炎支原體溶血素基因的克隆和原核表達
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株
        2.1.2 實驗器材
        2.1.3 主要試劑及溶液
        2.1.4 主要溶液的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 引物的設(shè)計
        2.2.2 基因組模板的制備
        2.2.3 PCR擴增反應(yīng)體系
        2.2.4 Hemolysin328基因的定點突變與克隆連接
        2.2.5 基因片段與PET32A質(zhì)粒載體的連接
        2.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞
        2.2.7 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
        2.2.8 測序鑒定
        2.2.9 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.10 重組蛋白的表達
        2.2.11 融合蛋白表達誘導(dǎo)條件的確定
        2.2.12 重組蛋白的表達純化
        2.2.13 蛋白濃度的測定
        2.2.14 目的蛋白的Western blot分析
        2.2.15 重組蛋白的溶血實驗
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 Hemolysin328基因片段的PCR反應(yīng)結(jié)果
        2.3.2 重組質(zhì)粒PCR測序結(jié)果
        2.3.3 融合蛋白誘導(dǎo)條件
        2.3.4 梯度濃度咪唑洗脫液洗脫蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳鑒定
        2.3.5 蛋白濃度測定的結(jié)果
        2.3.6 western blot結(jié)果
        2.3.7 溶血實驗結(jié)果
    2.4 討論與分析
        2.4.1 構(gòu)建能夠表達重組蛋白的質(zhì)粒
        2.4.2 表達系統(tǒng)的選擇
        2.4.3 重組蛋白誘導(dǎo)條件和可溶性的分析
        2.4.4 重組蛋白純化方法的選擇
        2.4.5 選擇溶血素蛋白的目的
3. 綿羊肺炎支原體的溶血素蛋白的免疫原性研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要溶液配制
        3.1.4 主要器材
    3.2 實驗方法
        3.2.1 制備疫苗
        3.2.2 免疫動物
        3.2.3 免疫血清的制備
        3.2.4 檢測免疫小鼠血清特異性抗體
        3.2.5 脾臟T淋巴細胞增殖實驗
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 血清特異性抗體水平檢測
        3.3.2 脾臟T細胞增殖實驗結(jié)果
    3.4 討論與分析
        3.4.1 特異性抗體水平的檢測
        3.4.2 脾臟T淋巴細胞增殖實驗
4. 結(jié)論
致謝
參考文獻
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]類山羊傳染性胸膜肺炎診斷和防治的研究——病原診斷[J]. 鄧光明,趙煊,梁桂香,方疇鑫,李志杰,王永寧,王慶粉,趙文學(xué),陳滿功,孫善財.  中國獸醫(yī)科技. 1991(06)
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博士論文
[1]絲狀支原體PG3株和綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙分離株基因組測序及可變表面脂蛋白基因克隆表達[D]. 徐春光.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013

碩士論文
[1]豬鏈球菌2型SLY與EF蛋白的原核表達及生物學(xué)特性鑒定[D]. 陳正濤.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號：3019567