狂犬病是由狂犬病病毒引起的侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種人畜共患傳染病,致死率幾乎為100%。2010年底至2013年初,在內(nèi)蒙古自治區(qū)一些奶牛飼養(yǎng)場和放牧區(qū)出現(xiàn)了奶�？袢硬±�,本文結(jié)合本次牛病,對該地區(qū)�？袢〔《镜姆肿由飳W(xué)特征和致病性做了較深入研究,以為狂犬病的防治提供依據(jù)。本研究對24個(gè)奶牛飼養(yǎng)場（戶）和1個(gè)放牧區(qū)17個(gè)病例（12例病牛和5例病犬）進(jìn)行發(fā)病情況、流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀觀察,以及對病死牛的病理學(xué)檢查、免疫熒光染色和病毒核酸檢測。選取3例典型病例的腦組織通過乳鼠腦內(nèi)接種,分離病毒。根據(jù)GenBank狂犬病病毒的基因序列,設(shè)計(jì)了PCR的16對引物和末端測序的3條引物,采取RACE和RT-PCR方法,對全基因組序列分段擴(kuò)增,拼接出病毒的全基因組序列,并對其進(jìn)行序列比對和遺傳演化分析。應(yīng)用分離的毒株分別經(jīng)肌肉和腦內(nèi)接種不同年齡段（1日、4日、10日、2周、3周和4周）的小鼠,研究不同病毒毒株的毒力及其在腦內(nèi)的分布和定位特征。用分離的毒株腦內(nèi)接種10日齡乳鼠,在發(fā)病瀕死期撲殺乳鼠,取腦組織,應(yīng)用病理組織學(xué)染色、透射電鏡、免疫熒光、原位雜交等方法,研究腦組織的病理組織學(xué)變化、超微... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：216 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
插圖和附表清單
縮略語表
1 引言
    1.1 病原學(xué)
        1.1.1 狂犬病毒的分類
        1.1.2 狂犬病病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)
    1.2 流行病學(xué)研究進(jìn)展
        1.2.1 傳染源和宿主
        1.2.2 傳播途徑
        1.2.3 影響發(fā)病的因素
        1.2.4 狂犬病流行范圍
    1.3 病理學(xué)研究
        1.3.1 病理學(xué)變化
        1.3.2 發(fā)病機(jī)理研究進(jìn)展
    1.4 狂犬病的診斷與防制
        1.4.1 狂犬病的診斷
        1.4.2 狂犬病的防制
    1.5 研究目的和意義
2 �？袢∽匀徊±牟±韺W(xué)研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 動(dòng)物自然病例發(fā)病情況與臨床癥狀
        2.2.2 自然病例病理學(xué)檢查
        2.2.3 自然病例核酸檢測
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
3 3株狂犬病病毒的全基因組測序
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 狂犬病犬牛腦標(biāo)本來源
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.3 狂犬病病毒全基因組測序所用標(biāo)本
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)道德規(guī)范
        3.1.5 主要儀器設(shè)備
        3.1.6 主要試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 接種用腦組織的處理
        3.2.2 接種方法
        3.2.3 小鼠接種后觀察
        3.2.4 接種后直接免疫熒光檢測
        3.2.5 用于狂犬病毒N基因序列的擴(kuò)增引物
        3.2.6 設(shè)計(jì)用于分段擴(kuò)增狂犬病病毒全基因組序列的引物
        3.2.7 設(shè)計(jì)用于病毒基因組末端的基因序列擴(kuò)增引物
        3.2.8 細(xì)胞總RNA的提取
        3.2.9 cDNA合成
        3.2.10 PCR和序列測定
        3.2.11 狂犬病病毒基因組末端的基因序列擴(kuò)增
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 狂犬病毒分離擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 直接免疫熒光檢測結(jié)果
        3.3.3 狂犬病毒N基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.4 全基因組序列PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果
        3.3.5 狂犬病毒的基因組全長與各基因及其編碼區(qū)域
    3.4 討論
        3.4.1 引物設(shè)計(jì)
        3.4.2 確保序列測定的準(zhǔn)確性
        3.4.3 全基因組的長度
        3.4.4 （G+C）%含量
    3.5 小結(jié)
4 3株內(nèi)蒙古狂犬病病毒的全基因組序列的分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 用于狂犬病毒全基因組序列分析的參考序列
        4.1.2 用于狂犬病病毒N基因序列分析的參考序列
    4.2 用于序列分析的生物信息學(xué)常用軟件
        4.2.1 用于序列拼接的ATGC軟件
        4.2.2 ClustalX（1.8）軟件
        4.2.3 BioEdit軟件
        4.2.4 GeneDoc軟件
        4.2.5 MEGA（5）軟件
        4.2.6 DNAStar（5.01）軟件包中MegAlign軟件
    4.3 狂犬病病毒的全基因組序列分析結(jié)果
        4.3.1 狂犬病毒全基因序列的同源性分析
        4.3.2 各結(jié)構(gòu)基因所編碼蛋白情況分析
        4.3.3 結(jié)構(gòu)蛋白基因同源性比較
        4.3.4 非編碼區(qū)序列比較
        4.3.5 各結(jié)構(gòu)蛋白的功能位點(diǎn)比較
    4.4 討論
        4.4.1 3株狂犬病毒街毒株N基因（核蛋白）分析
        4.4.2 基因組分子特征
        4.4.3 遺傳系譜間差異比較
        4.4.4 種系發(fā)生分析
        4.4.5 街毒株與疫苗株的比較研究
        4.4.6 同源性分析
        4.4.7 3株病毒致病性差異分析
    4.5 小結(jié)
5 牛狂犬病病毒毒株實(shí)驗(yàn)感染小鼠的病理學(xué)研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)道德規(guī)范
        5.1.2 病毒株
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        5.1.4 病毒懸液的制備與病毒滴度的檢測
        5.1.5 狂犬病病毒的接種與接種后觀察
        5.1.6 小鼠腦組織的收集與組織切片的制備
        5.1.7 狂犬病病毒特異性抗原定位
        5.1.8 電鏡檢查
        5.1.9 腦標(biāo)本的病理組織學(xué)觀察
        5.1.10 腦組織切片CD3+T淋巴細(xì)胞的免疫熒光染色
        5.1.11 CD11b小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光染色
        5.1.12 活化的半胱天冬酶-3（Caspase-3）的間接免疫熒光染色
        5.1.13 微管相關(guān)蛋白（MAP-2）的免疫熒光染色
        5.1.14 神經(jīng)細(xì)胞MAP-2與狂犬病毒抗原共定位
        5.1.15 IL-1βmRNA、RANTES mRNA及TIMP-1 mRNA原位雜交檢測
        5.1.16 腦組織免疫熒光染色與激光掃描共聚焦觀察
        5.1.17 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 乳鼠接種病毒后的腦內(nèi)病毒滴度、體重變化及病死率
        5.2.2 外周和顱內(nèi)兩種接種方式對不同年齡段小鼠的致病性和感染能力
        5.2.3 狂犬病病毒特異性抗原檢測結(jié)果
        5.2.4 神經(jīng)細(xì)胞與神經(jīng)纖維的病理變化
        5.2.5 電鏡檢查
        5.2.6 3株狂犬病毒在發(fā)病后瀕死前乳鼠腦內(nèi)的抗原分布
        5.2.7 3株狂犬病毒在乳鼠腦組織內(nèi)不同部位的病毒抗原含量
        5.2.8 乳鼠腦組織內(nèi)CD3+T淋巴細(xì)胞的浸潤
        5.2.9 乳鼠腦組織內(nèi)CD11b小膠質(zhì)細(xì)胞的活化
        5.2.10 3株狂犬病毒乳鼠腦組織內(nèi)Caspase-3免疫熒光染色結(jié)果
        5.2.11 乳鼠腦組織微管相關(guān)蛋白2的熒光免疫熒光染色結(jié)果
        5.2.12 乳鼠腦組織病毒抗原與微管相關(guān)蛋白2病變的相關(guān)性
        5.2.13 乳鼠腦組織狂犬病病毒抗原陽性細(xì)胞激光掃描共聚焦觀察結(jié)果
        5.2.14 乳鼠腦組織原位雜交IL-1β mRNA染色結(jié)果
        5.2.15 乳鼠腦組織原位雜交RANTES mRNA染色結(jié)果
        5.2.16 乳鼠腦組織原位雜交TIMP-1 mRNA染色結(jié)果
    5.3 討論
        5.3.1 乳鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的病理學(xué)變化
        5.3.2 3株病毒腦組織內(nèi)抗原分布差異分析
        5.3.3 3株病毒致乳鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況
        5.3.4 乳鼠腦組織炎性細(xì)胞情況
        5.3.5 乳鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞樹突的病變
        5.3.6 乳鼠腦組織狂犬病病毒抗原陽性細(xì)胞免疫熒光方法特異性鑒定
        5.3.7 乳鼠腦組織原位雜交IL-1β mRNA染色結(jié)果
        5.3.8 乳鼠腦組織原位雜交RANTES mRNA染色結(jié)果
        5.3.9 乳鼠腦組織原位雜交TIMP-1 mRNA染色結(jié)果
    5.4 小結(jié)
6 結(jié)論
7 創(chuàng)新點(diǎn)
致謝
附錄
參考文獻(xiàn)
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]低氧對大鼠大腦皮層細(xì)胞表達(dá)IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的影響[J]. 李華華,婁淑杰.  神經(jīng)解剖學(xué)雜志. 2013(02)
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[3]氧化苦參堿對腦外傷大鼠腦組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影響[J]. 董曉巧,俞文華,張祖勇,朱強(qiáng),車志豪,陳鋒,杜權(quán),王昊,陳軍.  浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2012(07)
[4]公雞生殖器官組織結(jié)構(gòu)及其IL-1β和IL-6在生殖器官中的定位[J]. 陳毅,曾長軍,周光斌,賴松家,張明.  四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2012(02)
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[7]炎癥相關(guān)因子IL-1β,TGF-β及MCP-1在肝細(xì)胞肝癌的表達(dá)[J]. 沈國定,姜潤秋,孫倍成.  江蘇醫(yī)藥. 2011(07)
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[9]黃芪總苷和三七總皂苷配伍對腦缺血再灌注后MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響[J]. 黃小平,譚華,陳北陽,鄧常清.  中國中藥雜志. 2010(16)
[10]miR-125a調(diào)節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者T細(xì)胞炎癥性趨化因子RANTES的表達(dá)[J]. 趙遐,唐元家,曲波,崔慧娟,王樹軍,王立珈,黃新芳,陳順樂,沈南.  現(xiàn)代免疫學(xué). 2010(03)

博士論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3017988