喹噁啉類化合物具有共同的喹嗯啉-1,4-二氮氧基本結(jié)構(gòu),主要有卡巴氧（Carbadox,CBX）、喹乙醇（Olaquindox,OLA）、乙酰甲喹（Mequindox, MEQ）、喹烯酮（Quinocetone, QCT）和喹賽多（Cyadox, CYA）。該類化合物具有明顯的抗菌促生長作用,被廣泛用作飼料添加劑和生長促進(jìn)劑�？ò脱鹾袜掖家蚓哂袧撛诘闹禄�、致癌以及致突變特性,被歐盟禁止用于畜禽飼料添加劑中。乙酰甲喹、喹烯酮為我國自主研制的新型喹噁啉藥物,但有研究報(bào)道乙酰甲喹和喹烯酮能夠損傷DNA。卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮和乙酰甲喹具有一定的遺傳毒性效應(yīng),但是對于該類化合物遺傳毒性分子機(jī)理并不清楚。研究普遍認(rèn)為,該類化合物致DNA損傷是和自由基（ROS）密切相關(guān),然而對于ROS的來源、種類以及ROS與DNA損傷的關(guān)系并不清楚。另外是否還存在有其它DNA損傷機(jī)理,也缺少相關(guān)研究資料。該類化合物遺傳毒性共同點(diǎn)是能夠引起哺乳動物細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂。本課題從ROS與DNA損傷、藥物與DNA結(jié)合作用、拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase, Topo）活性以及DNA復(fù)制與損傷修復(fù)酶基因表達(dá)四個角度... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語錄
1 前言
    1.1 研究背景
    1.2 藥物遺傳毒性分子機(jī)理研究進(jìn)展
        1.2.1 喹噁啉類藥物遺傳毒性研究進(jìn)展
        1.2.2 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制機(jī)理研究進(jìn)展
        1.2.3 自由基與氧化性DNA損傷研究進(jìn)展
        1.2.4 小分子化合物與DNA結(jié)合作用研究進(jìn)展
        1.2.5 DNA損傷修復(fù)酶
    1.3 目的與意義
        1.3.1 研究思路
        1.3.2 研究內(nèi)容
        1.3.3 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 細(xì)胞系
    2.2 藥品和試劑
    2.3 主要儀器和設(shè)備
    2.4 溶液配制
    2.5 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代與凍存
    2.6 MTT法檢測喹噁啉類藥物對HepG2細(xì)胞和V79細(xì)胞活力的影響
    2.7 單細(xì)胞凝膠電泳（彗星實(shí)驗(yàn)）檢測各種喹噁啉藥物致細(xì)胞DNA斷裂效應(yīng)
    2.8 喹烯酮與核酸結(jié)合檢測
        2.8.1 紫外吸收光譜法檢測喹烯酮和脫二氧喹烯酮與小牛胸腺DNA結(jié)合作用
        2.8.2 HPLC法檢測喹烯酮和脫二氧喹烯酮與單核苷酸加合作用
    2.9 喹烯酮作用下自由基檢測
        2.9.1 熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)ROS
        2.9.2 NBT還原法檢測喹烯酮代謝產(chǎn)生超氧陰離子自由基
        2.9.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測喹烯酮對DNA影響
        2.9.4 熒光探針檢測喹烯酮處理后胞內(nèi)超氧陰離子自由基
        2.9.5 ELISA檢測試劑盒檢測8-OHdG
        2.9.6 喹烯酮代謝物的檢測
    2.10 拓?fù)洚悩?gòu)酶活性檢測
        2.10.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測喹烯酮作用下拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性
        2.10.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測喹烯酮作用下HepG2細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶活性
        2.10.3 TARDIS技術(shù)檢測DNA-TopoⅡ復(fù)合物
    2.11 線粒體DNA突變檢測
        2.11.1 高鹽沉淀法提取線粒體DNA
        2.11.2 線粒體DNA基因引物設(shè)計(jì)
        2.11.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)
        2.11.4 測序
    2.12 實(shí)時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)
        2.12.1 總RNA的提取
        2.12.2 總RNA純度及完整性的檢測
        2.12.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.12.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測目的基因mRNA表達(dá)水平
        2.12.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 HepG2細(xì)胞和V79細(xì)胞培養(yǎng)
    3.2 喹噁啉類藥物對真核細(xì)胞活力影響
        3.2.1 對HepG2細(xì)胞細(xì)胞活力影響
        3.2.2 對V79細(xì)胞細(xì)胞活力影響
    3.3 喹噁啉類藥物對真核細(xì)胞DNA斷裂的影響
    3.4 喹烯酮與DNA結(jié)合的研究
        3.4.1 喹烯酮與小牛胸腺DNA結(jié)合作用
        3.4.2 喹烯酮與單核苷酸結(jié)合作用的研究
    3.5 喹烯酮代謝產(chǎn)生自由基
        3.5.1 喹烯酮作用HepG2細(xì)胞后胞內(nèi)自由基釋放的時效量效關(guān)系
        3.5.2 喹烯酮在代謝酶作用下代謝產(chǎn)生超氧陰離子自由基
        3.5.3 喹烯酮代謝對DNA的損傷
        3.5.4 喹烯酮引起HepG2細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子自由基
        3.5.5 喹烯酮和脫二氧喹烯酮對HepG2細(xì)胞超氧陰離子自由基的影響
        3.5.6 自由基清除劑對喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞超氧陰離子自由基的影響
        3.5.7 喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生8-OHdG
        3.5.8 喹稀酮作用HepG2細(xì)胞代謝物鑒定結(jié)果
    3.6 喹烯酮對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性影響
        3.6.1 喹烯酮抑制拓?fù)洚悩?gòu)Ⅱ活性
        3.6.2 喹烯酮抑制HepG2細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶活性
        3.6.3 喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA-TopoⅡ復(fù)合物
    3.7 喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞線粒體DNA突變
        3.7.1 線粒體DNA提取物鑒定
        3.7.2 喹烯酮誘導(dǎo)線粒體DNA突變
    3.8 喹烯酮對HepG2細(xì)胞基因表達(dá)的影響
        3.8.1 RNA質(zhì)量的鑒定
        3.8.2 喹烯酮對HepG2細(xì)胞基因表達(dá)的影響
4 討論
    4.1 細(xì)胞、藥物以及毒性指標(biāo)的選擇
        4.1.1 毒性判斷指標(biāo)以及指標(biāo)研究方法的選擇
        4.1.2 細(xì)胞、藥物、作用時間和劑量的選擇
    4.2 喹烯酮氧化性DNA損傷的機(jī)理
        4.2.1 喹烯酮誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的種類與來源
        4.2.2 ROS與DNA損傷關(guān)系
        4.2.3 ROS與線粒體DNA損傷
        4.2.4 ROS介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)酶抑制與DNA斷裂損傷的關(guān)系
    4.3 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性抑制與DNA斷裂損傷關(guān)系
    4.4 DNA加合物與DNA損傷關(guān)系
5 全文總結(jié)
6 文獻(xiàn)綜述
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄



本文編號：3017650