剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）能夠機會性地感染包括人和家禽在內(nèi)的幾乎所有的溫血動物并入侵這些宿主的有核細(xì)胞。弓形蟲的生活史復(fù)雜,感染途徑多樣,并且弓形蟲病可嚴(yán)重影響人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。然而,目前尚未研制出預(yù)防弓形蟲感染的有效疫苗和針對弓形蟲組織包囊的有效藥物。頂質(zhì)體是頂復(fù)門原蟲特有的細(xì)胞器,來源于二次內(nèi)共生。頂質(zhì)體盡管不進(jìn)行光合作用,但它包含了多條重要的合成代謝途徑。由于人類宿主缺乏質(zhì)體,故頂質(zhì)體成為重要的藥物靶標(biāo)。除己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶外,弓形蟲的其它糖酵解酶都有兩個亞型。其中,丙酮酸激酶PYK2、磷酸甘油酸激酶PGK2和磷酸丙糖異構(gòu)酶TPI2均定位在頂質(zhì)體。PYK2被認(rèn)為催化磷酸烯醇式丙酮酸為頂質(zhì)體提供丙酮酸和ATP且PGK2被認(rèn)為催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸并產(chǎn)生ATP。因此,本研究旨在對定位在頂質(zhì)體的糖酵解酶進(jìn)行生理功能和進(jìn)化起源分析,為解析弓形蟲頂質(zhì)體的代謝機制提供理論依據(jù)。本研究首先對弓形蟲的糖酵解酶進(jìn)行了定位分析,隨后對頂質(zhì)體的PYK2和PGK2進(jìn)行功能研究,最后對定位在頂質(zhì)體的糖酵解酶進(jìn)行進(jìn)化分析。具體工作包括以下幾個... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

弓形蟲復(fù)雜的生活史(HunterandSibley2012)

形蟲糖酵解酶的定位 2007 年，Tobias Fleige 就已經(jīng)對弓形蟲基因組編碼的 18 個糖酵解和定位分析。該學(xué)者首先找到基因的起始密碼子，然后在體外構(gòu)建編碼區(qū) ORF 及 C 端融合 myc 標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)表達(dá)質(zhì)粒至弓目的蛋白在蟲體內(nèi)的定位 (Fleige et al 2007)。雖然該方法為這些糖胞定位提供了重要信息,也發(fā)現(xiàn)了有些酶定位到頂質(zhì)體而不是細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。然而，該方法在技術(shù)上有一定的缺陷，比如異位表達(dá)為編碼區(qū)預(yù)測不準(zhǔn)確而導(dǎo)致蛋白定位出現(xiàn)偏差。在弓形蟲中，除 余 8 種糖酵解酶都有兩個亞型。已有研究明確 ENO1 和 ENO2 表達(dá)可與核染色質(zhì)結(jié)合（Jiapeng Ruan 2015）。ALD1 是目前公認(rèn)的細(xì)白而 ALD2 幾乎不表達(dá)（ToxoDB 數(shù)據(jù)）。故本研究擬采用原位融的方法重新觀察除 ENOs 和 ALDs 外的 14 個糖酵解酶（HK、GPI、PPIs、GAPDHs、PGMs 和 PFKs）的定位,圖 4-1 展示的是內(nèi)源性融的方法觀察目的蛋白定位的示意圖。

pCRISPR-GAPDH2-Ty 質(zhì)粒電泳鑒定及：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) 1：pCRISPR-GAPD2：pCRISPR-GAPDH2-Ty 質(zhì)粒的 Sal I 酶el electrophoresis of pCRISPR-GAPDH2-Tdigestion of pCRISPR-GAPDH2-Ty plasM: DNA marker 1: pCRISPR-GAPDH2tion of Sal I enzyme digestion of pCRISPR3’UTR-DHFR 質(zhì)粒為模板，上游引物游引物帶有 gRNA 位點后的 50 bp50 bp）的大小為 3845 bp 的 5H-Ty GAPDH2 短同源臂的 5H-Ty-3’UTRer-smFP-DHFR-LoxP-T7（圖譜見附的大小為 5505bp 的 5H-smHA-DHF源臂的 5H-smHA-DHFR-3H 片段。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人畜共患弓形蟲病的防治[J]. 夏奎波.  獸醫(yī)導(dǎo)刊. 2018(21)
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[3]一例豬弓形體病的診治與體會[J]. 吳太華.  畜禽業(yè). 2017(04)
[4]一例由豬弓形蟲病引起流產(chǎn)的診治[J]. 范永紅.  黑龍江動物繁殖. 2017(01)
[5]線粒體丙酮酸載體與腫瘤的研究進(jìn)展[J]. 李小麗,李亞青,鐘亞莉,樊慧杰,張明智,索振河.  醫(yī)學(xué)綜述. 2014(16)
[6]我國的食源性寄生蟲病及其相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 劉明遠(yuǎn),劉全,方維煥,尹繼剛,王學(xué)林,李建華,姜寧,張西臣,白雪,吳秀萍.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2014(07)
[7]頂復(fù)門原蟲類異戊二烯生物合成途徑及其關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展[J]. 廖申權(quán),吳彩艷,戚南山,呂敏娜,覃宗華,孫銘飛.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2012(02)
[8]抗弓形蟲藥物研究進(jìn)展[J]. 張瑞巖,劉全,商立民,吳永魁.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2010(01)
[9]頂復(fù)門寄生蟲頂質(zhì)體的研究進(jìn)展[J]. 張維,劉群.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2006(08)

博士論文
[1]與弓形蟲微線體蛋白互作的宿主蛋白的篩選和鑒定[D]. 王一凡.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015



本文編號：3004602