Sohlh2（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix2）是bHLH（basic helix-loop-helix）轉錄因子超家族的成員,是啟動原始卵泡發(fā)育的關鍵基因之一,制備轉有Sohlh2基因的動物具有重要的科研價值和應用價值。而在制備轉基因動物的方法中,精子載體法以操作簡單,人為機械損傷較少的優(yōu)點,受廣大研究者的矚目。與此同時,精子載體法陽性率不高的問題得不到妥善解決,需要在精子載體法的基礎上提高外源基因進入精子的效率,以達到提高陽性率的目的,細胞穿膜肽就是一種較好的解決方案。穿膜肽是由不多于30個氨基酸殘基組成的小分子多肽,具有很強的跨膜轉運能力。本研究擬比較細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs）用于不同細胞轉染的轉染效率,之后探討將篩選的CPPs用于精子載體法制備轉Sohlh2基因豬胚胎的可行性。具體研究結果如下。1.Sohlh2基因全長編碼區(qū)序列片段的克隆。基因包含全長編碼序列的擴增片段大小為1281bp,應用MEGA和ORF Finder等程序對所得序列... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 綜述文獻
    1. Sohlh2基因的生理功能
    2. 轉基因動物生產(chǎn)制備研究進展
        2.1 反轉錄病毒感染法
        2.2 顯微注射法
        2.3 胚胎干細胞法
        2.4 體細胞核移植法
        2.5 精子載體法
    3. 精子捕獲并內化外源DNA的分子機制,SMGT的影響因素及存在問題
        3.1 SMGT精子捕獲并內化外源DNA的分子機制
        3.2 外源DNA對SMGT的效率影響
        3.3 精子質量對SMGT的效率影響
        3.4 精子與外源基因孵育時間、溫度及混合比例對SMGT效率的影響
        3.5 孵育溶液中的電荷密度對SMGT效率的影響
        3.6 SMGT存在的問題
    4. 細胞穿膜肽的定義以及研究進展
        4.1 細胞穿膜肽的結構特點以及分類
        4.2 細胞穿膜肽與外源物質的連接方式
        4.3 細胞穿膜肽的穿膜機制
    5. 研究的目的和意義
第二章 水牛Sohlh2基因克隆及生物信息學分析
    1 試驗材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試驗方法
    2 試驗結果
        2.1 總RNA的提取
        2.2 克隆得到的水牛Sohlh2基因
        2.3 水牛Sohlh2基因pMD18-T重組質�？寺〖拌b定
        2.4 序列提交
        2.5 Sohlh2基因生物信息學分析
    3 分析與討論
        3.1 水牛Sohlh2基因的克隆
        3.2 水牛Sohlh2基因的生物信息學分析
    4 結論
第三章 水牛Sohlh2基因表達模式的研究
    1 試驗材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試驗方法
    2 試驗結果
        2.1 定量引物驗證
        2.2 Sohlh2基因在水牛組織中表達模式的建立
        2.3 Sohlh2基因真核表達載體及慢病毒載體的構建
        2.4 慢病毒包裝及滴度測定
    3 分析和討論
        3.1 Sohlh2基因在不同組織的mRNA表達
        3.2 構建Sohlh2基因的慢病毒載體
    4 結論
第四章 穿膜肽在不同細胞及精子上的轉染效率
    1 材料和方法
        1.1 材料
        1.2 試驗方法
    2 實驗結果
        2.1 探討C105y和Sohlh2基因質粒孵育條件及不同細胞類型對五種穿膜肽轉染效果的影響
        2.2 流式細胞儀檢測不同穿膜肽的轉染效率
        2.3 穿膜肽與探針fam在不同孵育液和孵育溫度下對豬精子轉染效果的影響
    3 分析討論
        3.1 探討C105y和Sohlh2基因質粒孵育條件及不同細胞類型對五種穿膜肽轉染效果的影響
        3.2 流式細胞儀檢測不同穿膜肽的轉染效率
        3.3 穿膜肽與探針fam在不同孵育液和孵育溫度下對豬精子轉染效果的影響
    4 結論
第五章 利用穿膜肽和慢病毒進行IVF制備轉Sohlh2基因豬胚胎
    1 材料和方法
        1.1 材料
        1.2 試驗方法
    2 實驗結果
        2.1 不同方式處理精子對精子活率、平均曲線運動速度（VCL）、平均直線運動速度（VSL）和前向性（STR）影響
        2.2 不同載體（慢病毒和穿膜肽C105y）對轉Sohlh2基因豬胚胎發(fā)育的影響
    3 分析與討論
        3.1 不同方式處理精子對精子活率、平均曲線運動速度（VCL）、平均直線運動速度（VSL）和前向性（STR）影響
        3.2 不同載體（慢病毒和穿膜肽C105y）對轉Sohlh基因豬胚胎發(fā)育的影響
    4 結論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[3]Bmp4/Smad信號通路在小鼠原始卵泡發(fā)育中的作用及作用機制[D]. 丁祥云.山東大學 2013
[4]Bmp4/Smad信號通路在小鼠精原干細胞分化過程中的作用及其機制研究[D]. 李毅.山東大學 2012
[5]狂犬病病毒糖蛋白基因重組慢病毒載體的構建及免疫試驗[D]. 房麗君.吉林大學 2011
[6]利用慢病毒載體制備轉基因小鼠和牛胚胎的研究[D]. 孫克寧.河南農(nóng)業(yè)大學 2011
[7]豬精子介導基因轉移技術優(yōu)化研究[D]. 周輝云.揚州大學 2011
[8]二甲基亞砜（DMSO）增強細胞膜穿透肽TAT穿膜效率的實驗研究[D]. 王琥.三峽大學 2010
[9]蜂毒短肽疏水性尾部增加陽離子聚合物的基因轉染效率及其在siRNA轉染中的應用[D]. 王穎麗.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 2008
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本文編號：3003206