發(fā)布時(shí)間：2021-01-23 17:52

　　奶牛乳腺炎是世界范圍內(nèi)影響奶牛業(yè)最大的疾病。在眾多能引起奶牛乳腺炎的病原中,S.aureus是危害最大的。由于抗生素的濫用和疫苗等生物制品的不健全導(dǎo)致乳腺炎的防治非常困難,而根本的原因還在于現(xiàn)階段人們對(duì)S.aureus乳腺炎的感染損傷機(jī)制還不清楚,因此探索S.aureus乳腺炎發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的分子機(jī)制迫在眉睫。中性粒細(xì)胞是奶牛乳腺抵御病原菌侵襲的第一道防線,它的凋亡對(duì)于控制乳腺炎癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要,在解除奶牛不良炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。為了探索奶牛S.aureus乳腺炎發(fā)生時(shí)中性粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,找到調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因,本實(shí)驗(yàn)在體外37℃,5%C02的條件下培養(yǎng)從奶牛外周血中分離到的中性粒細(xì)胞,向培養(yǎng)基中以50：1的比例加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S.aureus,分別在共培養(yǎng)Oh,2h,4h,6h,8h,10h后用PITC/PI雙染法通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡情況。最后利用基因芯片技術(shù)篩選出與中性粒細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因,并通過(guò)qPCR對(duì)芯片結(jié)果加以驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果有以下幾個(gè)方面：1、中性粒細(xì)胞體外培養(yǎng)存活情況體外培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞的活細(xì)胞比例隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷下降... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 文獻(xiàn)綜述
    前言
    1.1 奶牛S.aureus乳腺炎研究進(jìn)展
        1.1.1 奶牛S.aureus乳腺炎的發(fā)病機(jī)制
        1.1.2 奶牛S.aureus乳腺炎的危害
        1.1.3 奶牛S.aureus乳腺炎的防治措施
    1.2 中性粒細(xì)胞凋亡與炎癥修飾
        1.2.1 中性粒細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象
        1.2.2 中性粒細(xì)胞凋亡的影響因素
        1.2.3 中性粒細(xì)胞凋亡的分子改變
        1.2.4 中性粒細(xì)胞凋亡的誘發(fā)通路
        1.2.5 中性粒細(xì)胞凋亡與存活的調(diào)節(jié)
        1.2.6 中性粒細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)
        1.2.7 中性粒細(xì)胞凋亡與S.aureus乳腺炎的關(guān)系
    1.3 基因芯片技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.3.1 基因芯片技術(shù)的原理
        1.3.2 基因芯片的主要類(lèi)型
        1.3.3 基因芯片技術(shù)的主要步驟
        1.3.4 基因芯片技術(shù)的特點(diǎn)
        1.3.5 基因芯片技術(shù)的應(yīng)用
2 目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 細(xì)胞
        3.1.3 培養(yǎng)基
        3.1.4 細(xì)胞提取試劑盒
        3.1.5 熒光定量PCR相關(guān)引物
        3.1.6 主要試劑
        3.1.7 主要儀器
    3.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)
    3.3 中性粒細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定
        3.3.1 中性粒細(xì)胞的提取
        3.3.2 中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.3.3 中性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)
        3.3.4 中性粒細(xì)胞的鑒定
        3.3.5 中性粒細(xì)胞的存活曲線測(cè)定
    3.4 中性粒細(xì)胞的細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)
    3.5 中性粒細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
    3.6 S.aureus誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)譜測(cè)定
    3.7 芯片結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）驗(yàn)證
        3.7.1 細(xì)胞RNA的提取
        3.7.2 RNA的純化
        3.7.3 基因組DNA的除去反應(yīng)
        3.7.4 cDNA的合成反應(yīng)
        3.7.5 SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        3.7.6 相對(duì)mRNA表達(dá)水平的計(jì)算
4 結(jié)果與分析
    4.1 中性粒細(xì)胞的鑒定結(jié)果
    4.2 中性粒細(xì)胞的存活曲線
    4.3 S.aureus誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡情況
    4.4 樣品RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
    4.5 基因芯片結(jié)果
    4.6 qPCR驗(yàn)證結(jié)果
5 討論
    5.1 中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)
    5.2 中性粒細(xì)胞的凋亡與細(xì)菌感染
    5.3 S.aureus誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因表達(dá)情況
        5.3.1 Bcl-2基因
        5.3.2 IL1
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]淺談奶牛乳腺炎的防控措施[J]. 朱興貴.  上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2012(05)
[2]奶牛乳腺炎的預(yù)防措施[J]. 周洪君,周慶民.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2012(09)
[3]奶牛乳腺炎的病因分析及防治措施[J]. 周崇平.  養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn). 2012(02)
[4]奶牛乳腺炎的綜合防治[J]. 田崇剛.  農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備. 2011(11)
[5]奶牛乳腺炎的診斷與防治[J]. 韓曉玲,趙長(zhǎng)志.  養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn). 2011(04)
[6]奶牛乳腺炎的發(fā)生及綜合性防治[J]. 趙秀偉,王維.  黑龍江動(dòng)物繁殖. 2011(02)
[7]奶牛乳腺炎防治方法的研究進(jìn)展[J]. 朱文娟,鄧干臻.  北方牧業(yè). 2008(09)
[8]湖北地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與耐藥性分析[J]. 劉朝,王京仁,張成棟,吳波,韓永佩,趙波,余亞軍,王建華,劉友斌,程貴寶,馮哲,田地,陳煥春,郭愛(ài)珍.  中國(guó)奶牛. 2007(07)
[9]奶牛乳腺炎的研究進(jìn)展[J]. 方振華,高騰云,丁利.  上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2007(02)
[10]奶牛乳腺炎研究進(jìn)展[J]. 曹訪,唐修君,陳麗,王杏龍.  黑龍江動(dòng)物繁殖. 2006(04)



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