為明確羊口瘡病毒ORFV129錨蛋白在細(xì)胞中的定位,參照GenBank中收錄的ORFV SY 17全基因組（登錄號(hào):MG 712417.1）序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增ORFV129基因完整編碼框并測(cè)序鑒定,利用生物信息學(xué)軟件分析該基因編碼蛋白的氨基酸序列、蛋白跨膜區(qū)域,預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位;并將ORFV129完整基因連接到真核表達(dá)載體pEGFP-N1,經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定是否成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-ORFV129;利用LipoGene^TM 2000介導(dǎo)將pEGFP-ORFV129轉(zhuǎn)染新生山羊睪丸原代細(xì)胞,通過(guò)Western Blot鑒定ORFV129蛋白是否正確表達(dá),同時(shí),經(jīng)DAPI核酸染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色后,激光共聚焦顯微鏡觀察ORFV129蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,成功擴(kuò)增ORFV129完整基因,該基因全長(zhǎng)大小為1 551 bp,測(cè)序鑒定其正確;生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),其編碼516個(gè)氨基酸,含有8種錨蛋白ANKs重復(fù)基序（ANKs）,不存在跨膜區(qū)域,亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì);Western Blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒的山... 

【文章來(lái)源】：華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2020,35(04)北大核心

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【部分圖文】：

ORFV129基因克隆及重組質(zhì)粒鑒定

轉(zhuǎn)染12～24 h后,將融合載體pEGFP-ORFV129和空載體pEGFP-N1置于熒光倒置顯微鏡下,均能觀察到綠色熒光(圖4)。mRNA表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后,可見(jiàn)與預(yù)期ORFV129基因大小相似的目的條帶(圖5),表明ORFV129基因在細(xì)胞中ORFV復(fù)制期間發(fā)生了轉(zhuǎn)錄。圖3 pEGFP-ORFV129的酶切鑒定

pEGFP-ORFV129的酶切鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]羊口瘡病毒119蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究[D]. 陳慧芹.南方醫(yī)科大學(xué) 2017



本文編號(hào)：2983517