病毒在非易感細(xì)胞或宿主中連續(xù)傳代后,適應(yīng)非易感細(xì)胞或宿主,同時(shí)在自然宿主中的毒力減弱,從而獲得弱毒疫苗。豬瘟兔化弱毒疫苗（C株或HCLV株）是在20世紀(jì)50年代將豬瘟病毒強(qiáng)毒株在家兔體內(nèi)連續(xù)傳480余代獲得的一株弱毒疫苗。與豬瘟強(qiáng)毒Shimen株相比,C株能夠適應(yīng)家兔,對(duì)豬無(wú)致病性。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn),E2蛋白是C株適應(yīng)家兔的關(guān)鍵蛋白。那么,E2蛋白是如何介導(dǎo)C株適應(yīng)家兔的?決定豬瘟病毒適應(yīng)家兔的分子基礎(chǔ)是否影響病毒在豬體內(nèi)的毒力?為解析E2蛋白介導(dǎo)的C株適應(yīng)家兔的分子機(jī)制,首先確定了C株適應(yīng)家兔的E2蛋白關(guān)鍵氨基酸。以C株為骨架構(gòu)建了包含Shimen株E2蛋白不同結(jié)構(gòu)域的嵌合病毒,通過(guò)家兔接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)位于E2蛋白Domain I是C株適應(yīng)家兔的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。下一步,對(duì)Domain I中的差異氨基酸進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)Domain I-2中的三個(gè)氨基酸位點(diǎn)（K105、P108和T109）能夠決定C株對(duì)家兔的適應(yīng)性。那么這三個(gè)位點(diǎn)中具體哪個(gè)氨基酸在C株適應(yīng)家兔中發(fā)揮作用呢?因此,構(gòu)建了單獨(dú)突變和兩兩組合突變的突變體病毒,通過(guò)家兔接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),P108和T109是C株適應(yīng)家兔的E2蛋白關(guān)鍵氨基酸。... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：86 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

豬只感染豬瘟病毒后的臨床癥狀

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是豬瘟的病原體,屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus),牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、邊界病病毒(Border disease virus)也屬于該病毒屬(王漢中,1996)。病毒顆粒的囊膜包含4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,分別是衣殼C蛋白和囊膜糖蛋白Erns、E1和E2。C蛋白內(nèi)有一條12.3 kb的單股正鏈RNA基因組,該基因組包含一個(gè)長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框,閱讀框的編碼區(qū)可以編碼一個(gè)多聚蛋白,位于編碼區(qū)兩側(cè)的分別為5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)(Untranslated region,UTR)。編碼的多聚蛋白在病毒和宿主蛋白酶的作用下產(chǎn)生13個(gè)成熟蛋白(李軍等,2007),包括已提到的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B 8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(圖1-2)。13個(gè)成熟蛋白在病毒的生命周期與感染過(guò)程中發(fā)揮不同的功能:(1)CSFV的非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)及其功能

HCV主要導(dǎo)致慢性肝炎,而全世界大約有1.8億慢性肝炎患者(LOHMANN et al.,1999;MOHD et al.,2013)。然而,由于缺乏細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),導(dǎo)致藥物和疫苗的研發(fā)受阻(WAKITA et al.,2005)。HCV的感染需要特定宿主因子來(lái)滿(mǎn)足病毒的侵入、RNA復(fù)制、組裝和病毒顆粒的釋放。HCV侵入細(xì)胞需要多個(gè)宿主因子的共同參與,最初病毒顆粒的吸附需要病毒核心蛋白、囊膜蛋白E1和E2與脂蛋白、黏多糖、凝集素、低密度脂蛋白受體在內(nèi)的多個(gè)宿主蛋白相互作用。除此之外,已鑒定的侵入因子包括B類(lèi)1型清道夫受體(Scavenger receptor class B type 1,SR-BI)、四跨膜蛋白CD81、緊密連接類(lèi)蛋白中的閉合蛋白1(Claudin-1,CLDN1)和封閉蛋白(Occludin,OCLN)。在多種哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞系過(guò)表達(dá)這四類(lèi)分子可以使非易感細(xì)胞獲得對(duì)HCV的容許性(PLOSS et al.,2009)。利用HCV復(fù)制子研究發(fā)現(xiàn)鼠源肝癌細(xì)胞能夠支持HCV的RNA進(jìn)行復(fù)制,同時(shí)在過(guò)表達(dá)人源侵入分子后,HCV也能夠侵入嚙齒類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞(ZHU et al.,2003)。這些證據(jù)表明與具有物種特異性的四種侵入受體的結(jié)合決定了HCV的宿主嗜性。不同物種CD81分子的胞外環(huán)結(jié)構(gòu)域差異性很大,而此結(jié)構(gòu)域決定了其與HCV E2蛋白的相互作用。Bitzegeio(2010)將HCV Jc1株感染過(guò)表達(dá)鼠源CD81而不表達(dá)人源CD81的細(xì)胞(Lunet N mCD81),連續(xù)傳代后發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變體位點(diǎn),其中位于病毒糖蛋白的3個(gè)位點(diǎn)的突變(E1-L216R、E2-V388G、E2-M405T)提高了病毒侵入Lunet N mCD81的效率。與親本病毒相比,3個(gè)點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)了病毒利用鼠源CD81受體的能力。利用可溶性蛋白阻斷試驗(yàn)和抗體封閉試驗(yàn)進(jìn)一步研究表明,三個(gè)位突變點(diǎn)很可能是促進(jìn)了病毒上CD81結(jié)合位點(diǎn)的暴露;受體競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)表明,突變體病毒對(duì)SR-BI的依賴(lài)性降低。而另一個(gè)可能的機(jī)制就是改變了病毒糖蛋白復(fù)合體的構(gòu)象,因?yàn)榭贵w中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變體病毒與抗E2特應(yīng)性抗體和抗E2蛋白羧基端特應(yīng)性抗體的結(jié)合能力增強(qiáng)。但是由于HCV E1/E2復(fù)合物結(jié)構(gòu)未知,不能最終確定上述機(jī)制研究是否互悖(BITZEGEIO et al.,2010)。人/猴免疫缺陷嵌合病毒(Simian–human immunodeficiency virus,SHIV)是以獼猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus of macaque,SIVmac)為骨架表達(dá)HIV的膜蛋白,其對(duì)于HIV疫苗的研發(fā)和治療具有重要的應(yīng)用前景(SHARMA et al.,2015)。據(jù)報(bào)道,利用SHIV可以評(píng)估廣譜中和抗體的誘導(dǎo)水平、廣譜單克隆中和抗體在臨床前試驗(yàn)中的抑制和治愈效果等(WALKER et al.,2011;YAMAMOTO et al.,2015;BAROUCH et al.,2013)。但是恒河猴作為HIV-1感染人類(lèi)的動(dòng)物模型而言存在顯著不足,即HIV-1 Env可以感染人類(lèi)CD4+T細(xì)胞,而不能感染恒河猴CD4(rhesus CD4,rh CD4)T細(xì)胞(FINZI et al.,2012),使得該系統(tǒng)的應(yīng)用受限。HIV-1 Env與受體CD4的相互作用,介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞,因此需要從宿主受體CD4和病毒蛋白Env兩個(gè)角度闡明HIV-1 Env不能感染rhCD4 T細(xì)胞的分子機(jī)制。人CD4的N-末端免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(D1)是與HIV-1 Env相互作用的主要結(jié)構(gòu)域,人源CD4與rh CD4的D1存在21個(gè)氨基酸的差異。Humes等研究表明,CD4受體中第39位氨基酸決定了HIV-1能否侵入靶細(xì)胞的種族差異性(HUMES et al.,2012)。結(jié)構(gòu)分析表明,人源CD4中的N39非常接近F43或R59,而F43或R59可以與gp120形成氫鍵使得吸附更加穩(wěn)定(KWONG et al.,1998)。雖然CD4 I39是阻礙HIV-1 Env結(jié)合rh CD4的關(guān)鍵改變,但huCD4中的相應(yīng)殘基(N39)實(shí)際上并不直接與HIV-1 Env相互作用,而是處于閉合狀態(tài)(融合前)或CD4結(jié)合狀態(tài)。相反,它臨近苯丙氨酸43(F43)殘基,與F43結(jié)合口袋中的Env殘基相互作用。在rh CD4中,通過(guò)模擬顯示,I39可以巧妙地改變F43結(jié)合環(huán)的角度。HIV-1 Env與CD4的結(jié)合需要多次結(jié)構(gòu)重組,而側(cè)鏈體積會(huì)顯著影響該重構(gòu)從而影響二者的相互作用。Li(2016a)通過(guò)分析SIV和HIV-1與CD4結(jié)合的Env殘基在配體結(jié)合中體積,發(fā)現(xiàn)HIV-1中第375位是絲氨酸,而在SIV中通常為體積較大的疏水性氨基酸,同時(shí)該位點(diǎn)不論在融合前還是與CD4結(jié)合時(shí)均與CD4的F43非常接近,并且在靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒中具有很大的進(jìn)化壓力。將第375位絲氨酸突變?yōu)閬?lái)源于不同Env骨架的氨基酸后可以增加Env對(duì)恒河猴CD4的親和性,使得病毒可以侵入表達(dá)rhCD4的細(xì)胞,還可使病毒可以在原代rhCD4 T細(xì)胞中復(fù)制。Env內(nèi)部結(jié)構(gòu)域gp120在結(jié)合CD4時(shí)自我折疊,其內(nèi)部、外部和橋接片狀結(jié)構(gòu)域在與CD4的界面處接近。這個(gè)過(guò)程會(huì)在HIV-1 gp120和CD4之間產(chǎn)生~150-?3腔,盡管Env蛋白第375位氨基酸不是其中之一,但它與保守的gp120殘基有許多接觸(ZHOU et al.,2007)。已有報(bào)道稱(chēng),HIV-1 gp120突變后即S375W可以填充該腔,使得該蛋白的結(jié)構(gòu)能夠自發(fā)地向與CD4結(jié)合時(shí)的狀態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)變,從而提高了與人源CD4的親和性(FINZI et al.,2010)。同樣,以不同的氨基酸替換SHIV Env蛋白第375位氨基酸很有可能是以相同的機(jī)制促進(jìn)與rh CD4的結(jié)合。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]豬瘟病毒致病的臨床生物學(xué)特性研究[D]. 徐鳳軍.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



本文編號(hào)：2977339