病毒在非易感細胞或宿主中連續(xù)傳代后,適應(yīng)非易感細胞或宿主,同時在自然宿主中的毒力減弱,從而獲得弱毒疫苗。豬瘟兔化弱毒疫苗（C株或HCLV株）是在20世紀(jì)50年代將豬瘟病毒強毒株在家兔體內(nèi)連續(xù)傳480余代獲得的一株弱毒疫苗。與豬瘟強毒Shimen株相比,C株能夠適應(yīng)家兔,對豬無致病性。本實驗室前期發(fā)現(xiàn),E2蛋白是C株適應(yīng)家兔的關(guān)鍵蛋白。那么,E2蛋白是如何介導(dǎo)C株適應(yīng)家兔的?決定豬瘟病毒適應(yīng)家兔的分子基礎(chǔ)是否影響病毒在豬體內(nèi)的毒力?為解析E2蛋白介導(dǎo)的C株適應(yīng)家兔的分子機制,首先確定了C株適應(yīng)家兔的E2蛋白關(guān)鍵氨基酸。以C株為骨架構(gòu)建了包含Shimen株E2蛋白不同結(jié)構(gòu)域的嵌合病毒,通過家兔接種試驗發(fā)現(xiàn)位于E2蛋白Domain I是C株適應(yīng)家兔的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。下一步,對Domain I中的差異氨基酸進一步分析,發(fā)現(xiàn)Domain I-2中的三個氨基酸位點（K105、P108和T109）能夠決定C株對家兔的適應(yīng)性。那么這三個位點中具體哪個氨基酸在C株適應(yīng)家兔中發(fā)揮作用呢?因此,構(gòu)建了單獨突變和兩兩組合突變的突變體病毒,通過家兔接種試驗發(fā)現(xiàn),P108和T109是C株適應(yīng)家兔的E2蛋白關(guān)鍵氨基酸。... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

豬只感染豬瘟病毒后的臨床癥狀

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是豬瘟的病原體,屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus),牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、邊界病病毒(Border disease virus)也屬于該病毒屬(王漢中,1996)。病毒顆粒的囊膜包含4個結(jié)構(gòu)蛋白,分別是衣殼C蛋白和囊膜糖蛋白Erns、E1和E2。C蛋白內(nèi)有一條12.3 kb的單股正鏈RNA基因組,該基因組包含一個長的開放閱讀框,閱讀框的編碼區(qū)可以編碼一個多聚蛋白,位于編碼區(qū)兩側(cè)的分別為5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)(Untranslated region,UTR)。編碼的多聚蛋白在病毒和宿主蛋白酶的作用下產(chǎn)生13個成熟蛋白(李軍等,2007),包括已提到的4個結(jié)構(gòu)蛋白,Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B 8個非結(jié)構(gòu)蛋白(圖1-2)。13個成熟蛋白在病毒的生命周期與感染過程中發(fā)揮不同的功能:(1)CSFV的非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)及其功能

HCV主要導(dǎo)致慢性肝炎,而全世界大約有1.8億慢性肝炎患者(LOHMANN et al.,1999;MOHD et al.,2013)。然而,由于缺乏細胞培養(yǎng)系統(tǒng),導(dǎo)致藥物和疫苗的研發(fā)受阻(WAKITA et al.,2005)。HCV的感染需要特定宿主因子來滿足病毒的侵入、RNA復(fù)制、組裝和病毒顆粒的釋放。HCV侵入細胞需要多個宿主因子的共同參與,最初病毒顆粒的吸附需要病毒核心蛋白、囊膜蛋白E1和E2與脂蛋白、黏多糖、凝集素、低密度脂蛋白受體在內(nèi)的多個宿主蛋白相互作用。除此之外,已鑒定的侵入因子包括B類1型清道夫受體(Scavenger receptor class B type 1,SR-BI)、四跨膜蛋白CD81、緊密連接類蛋白中的閉合蛋白1(Claudin-1,CLDN1)和封閉蛋白(Occludin,OCLN)。在多種哺乳類動物細胞系過表達這四類分子可以使非易感細胞獲得對HCV的容許性(PLOSS et al.,2009)。利用HCV復(fù)制子研究發(fā)現(xiàn)鼠源肝癌細胞能夠支持HCV的RNA進行復(fù)制,同時在過表達人源侵入分子后,HCV也能夠侵入嚙齒類動物細胞(ZHU et al.,2003)。這些證據(jù)表明與具有物種特異性的四種侵入受體的結(jié)合決定了HCV的宿主嗜性。不同物種CD81分子的胞外環(huán)結(jié)構(gòu)域差異性很大,而此結(jié)構(gòu)域決定了其與HCV E2蛋白的相互作用。Bitzegeio(2010)將HCV Jc1株感染過表達鼠源CD81而不表達人源CD81的細胞(Lunet N mCD81),連續(xù)傳代后發(fā)現(xiàn)4個突變體位點,其中位于病毒糖蛋白的3個位點的突變(E1-L216R、E2-V388G、E2-M405T)提高了病毒侵入Lunet N mCD81的效率。與親本病毒相比,3個點突變增強了病毒利用鼠源CD81受體的能力。利用可溶性蛋白阻斷試驗和抗體封閉試驗進一步研究表明,三個位突變點很可能是促進了病毒上CD81結(jié)合位點的暴露;受體競爭試驗表明,突變體病毒對SR-BI的依賴性降低。而另一個可能的機制就是改變了病毒糖蛋白復(fù)合體的構(gòu)象,因為抗體中和試驗發(fā)現(xiàn)突變體病毒與抗E2特應(yīng)性抗體和抗E2蛋白羧基端特應(yīng)性抗體的結(jié)合能力增強。但是由于HCV E1/E2復(fù)合物結(jié)構(gòu)未知,不能最終確定上述機制研究是否互悖(BITZEGEIO et al.,2010)。人/猴免疫缺陷嵌合病毒(Simian–human immunodeficiency virus,SHIV)是以獼猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus of macaque,SIVmac)為骨架表達HIV的膜蛋白,其對于HIV疫苗的研發(fā)和治療具有重要的應(yīng)用前景(SHARMA et al.,2015)。據(jù)報道,利用SHIV可以評估廣譜中和抗體的誘導(dǎo)水平、廣譜單克隆中和抗體在臨床前試驗中的抑制和治愈效果等(WALKER et al.,2011;YAMAMOTO et al.,2015;BAROUCH et al.,2013)。但是恒河猴作為HIV-1感染人類的動物模型而言存在顯著不足,即HIV-1 Env可以感染人類CD4+T細胞,而不能感染恒河猴CD4(rhesus CD4,rh CD4)T細胞(FINZI et al.,2012),使得該系統(tǒng)的應(yīng)用受限。HIV-1 Env與受體CD4的相互作用,介導(dǎo)病毒感染細胞,因此需要從宿主受體CD4和病毒蛋白Env兩個角度闡明HIV-1 Env不能感染rhCD4 T細胞的分子機制。人CD4的N-末端免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(D1)是與HIV-1 Env相互作用的主要結(jié)構(gòu)域,人源CD4與rh CD4的D1存在21個氨基酸的差異。Humes等研究表明,CD4受體中第39位氨基酸決定了HIV-1能否侵入靶細胞的種族差異性(HUMES et al.,2012)。結(jié)構(gòu)分析表明,人源CD4中的N39非常接近F43或R59,而F43或R59可以與gp120形成氫鍵使得吸附更加穩(wěn)定(KWONG et al.,1998)。雖然CD4 I39是阻礙HIV-1 Env結(jié)合rh CD4的關(guān)鍵改變,但huCD4中的相應(yīng)殘基(N39)實際上并不直接與HIV-1 Env相互作用,而是處于閉合狀態(tài)(融合前)或CD4結(jié)合狀態(tài)。相反,它臨近苯丙氨酸43(F43)殘基,與F43結(jié)合口袋中的Env殘基相互作用。在rh CD4中,通過模擬顯示,I39可以巧妙地改變F43結(jié)合環(huán)的角度。HIV-1 Env與CD4的結(jié)合需要多次結(jié)構(gòu)重組,而側(cè)鏈體積會顯著影響該重構(gòu)從而影響二者的相互作用。Li(2016a)通過分析SIV和HIV-1與CD4結(jié)合的Env殘基在配體結(jié)合中體積,發(fā)現(xiàn)HIV-1中第375位是絲氨酸,而在SIV中通常為體積較大的疏水性氨基酸,同時該位點不論在融合前還是與CD4結(jié)合時均與CD4的F43非常接近,并且在靈長類慢病毒中具有很大的進化壓力。將第375位絲氨酸突變?yōu)閬碓从诓煌珽nv骨架的氨基酸后可以增加Env對恒河猴CD4的親和性,使得病毒可以侵入表達rhCD4的細胞,還可使病毒可以在原代rhCD4 T細胞中復(fù)制。Env內(nèi)部結(jié)構(gòu)域gp120在結(jié)合CD4時自我折疊,其內(nèi)部、外部和橋接片狀結(jié)構(gòu)域在與CD4的界面處接近。這個過程會在HIV-1 gp120和CD4之間產(chǎn)生~150-?3腔,盡管Env蛋白第375位氨基酸不是其中之一,但它與保守的gp120殘基有許多接觸(ZHOU et al.,2007)。已有報道稱,HIV-1 gp120突變后即S375W可以填充該腔,使得該蛋白的結(jié)構(gòu)能夠自發(fā)地向與CD4結(jié)合時的狀態(tài)進行轉(zhuǎn)變,從而提高了與人源CD4的親和性(FINZI et al.,2010)。同樣,以不同的氨基酸替換SHIV Env蛋白第375位氨基酸很有可能是以相同的機制促進與rh CD4的結(jié)合。

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：2977339