本試驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）獲取貓Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc目的基因，根據(jù)NCBI公布的貓Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列設(shè)計(jì)合成了上、下游引物，并導(dǎo)入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，Oct4基因上下游引物分別加上NotI和BamHI酶切位點(diǎn)，Sox2、Klf4和c-Myc基因上下游引物分別加上NotI和NsiI酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增的基因片段連接T載體pUC57。酶切載體LV5和含目的基因的表達(dá)質(zhì)粒，將目的基因與攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒載體LV5進(jìn)行定向連接，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4和LV-c-Myc。將其連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)篩選陽性克隆、酶切鑒定后送測序，并通過lipofectamine2000介導(dǎo)將重組質(zhì)粒LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4和LV-c-Myc轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞對慢病毒進(jìn)行包裝轉(zhuǎn)染并收集病毒上清測定病毒滴度，取得以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（1）本試驗(yàn)成功克隆出貓Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的方法分別擴(kuò)增出片段大小為1083b... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖14個目的基因PCR擴(kuò)增1.Oct4;2.Sox2;3.Klf4;4.c-Myc；5.marker;Fig.1targetgenesamplicationbyPCR

4 個目的基因 PCR 鑒定（與 T 載體連接）1. Oct4;2. Sox2;3. Klf4;4. c-Myc；5.Fig. 2 PCR identification of four target genes （connected to T vector）接 T 載體的雙酶切鑒定接到 T 載體后對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑菌，搖菌，質(zhì)粒抽提，抽提的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶因用 NotI 和 BamHI 內(nèi)切酶酶切，Sox2、Klf4 和 c-Myc 基因分別用 NotI 和切，結(jié)果 1%瓊脂糖凝膠電泳后得到的目的基因片段與載體大小均與預(yù)期的片圖 3）。

個目的基因 PCR 鑒定（與 T 載體連接）1. Oct4;2. Sox2;3. Klf4;4. c-Myc；Fig. 2 PCR identification of four target genes （connected to T vector）接 T 載體的雙酶切鑒定到 T 載體后對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑菌，搖菌，質(zhì)粒抽提，抽提的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶因用 NotI 和 BamHI 內(nèi)切酶酶切，Sox2、Klf4 和 c-Myc 基因分別用 NotI 和切，結(jié)果 1%瓊脂糖凝膠電泳后得到的目的基因片段與載體大小均與預(yù)期的 3）。


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