牛支原體是牛的一種常見卻常被忽視的致病性病原,常導致牛只呼吸性疾病、乳房炎、關節(jié)炎等疾病。自2008年在湖北省首次發(fā)現(xiàn)以來,我國已超過10省份均有牛支原體暴發(fā)的報道。牛群在長距離運輸后更易發(fā)病,感染率為50%-100%,致死率高達10%-50%,給我國養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。適配體（Aptamer）是由指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（Systematic Evaluation Ligands by Exponential Enrichment,SELEX）技術篩選而來的DNA或RNA單鏈分子,它可以以類似抗原-抗體的方式與靶物質(zhì)特異性結合。本研究使用原核表達的P48蛋白進行牛支原體單克隆抗體的篩選。篩選得到的單克隆抗體株10E可識別所有牛支原體菌株（模式株PG45,中國分離株Hubei-1、SD-2、GY-2、PD-2、HRB-1、HY-1、HG-1）,與其它相關病原（無乳支原體、精氨酸支原體、牛鼻支原體、牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型）無交義反應,親和力高達6×1010 L/M。我們同樣采用微孔板作為介質(zhì),成功篩選到了 P48蛋白高親和力、高特異性單鏈... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 SELEX技術
        1.1.1 分離技術
        1.1.2 單鏈制備
        1.1.3 結合力的測定
    1.2 基于適配體的檢測應用平臺
        1.2.1 光學適配體生物傳感器
        1.2.2 質(zhì)量靈敏傳感器
        1.2.3 電化學適配體傳感器
        1.2.4 酶聯(lián)適配體學說
        1.2.5 納米材料傳感器
    1.3 牛支原體
        1.3.1 病原學
        1.3.2 流行病學
        1.3.3 牛支原體膜蛋白研究現(xiàn)狀
        1.3.4 牛支原體的檢測
    1.4 研究目的與意義
第二章 原核表達牛支原體P48蛋白
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及實驗動物
        2.1.2 儀器
        2.1.3 試劑
    2.2 方法
        2.2.1 牛支原體全基因組DNA的提取
        2.2.2 P48基因擴增及測序
        2.2.3 P48基因定點突變
        2.2.4 P48蛋白表達及純化
        2.2.5 Western Blotting驗證P48蛋白
    2.3 結果
        2.3.1 P48基因的擴增
        2.3.2 P48基因測序
        2.3.3 基因定點突變
        2.3.4 P48蛋白原核表達及純化
        2.3.5 Western Blotting
    2.4 討論
        2.4.1 關于P48蛋白
        2.4.2 關于P48基因突變
        2.4.3 關于選擇pET28 a（+）)質(zhì)粒
    2.5 小結
第三章 牛支原體P48蛋白單克隆抗體的篩選
    3.1 材料
        3.1.1 菌株、毒株及實驗動物
        3.1.2 儀器
        3.1.3 試劑
    3.2 方法
        3.2.1 小鼠免疫
        3.2.2 間接ELISA的建立
        3.2.3 雜交瘤細胞株的建立
        3.2.4 單克隆抗體的生產(chǎn)
        3.2.5 單抗特性的鑒定
    3.3 結果
        3.3.1 間接ELISA抗原濃度、一抗血清稀釋度的優(yōu)化以及6只免疫小鼠抗體效價的測定
        3.3.2 陰陽性臨界值的確定
        3.3.3 雜交瘤細胞株的建立
        3.3.4 單抗的鑒定和特性分析
    3.4 討論
        3.4.1 關于小鼠免疫
        3.4.2 關于亞克隆
        3.4.3 關于表位
        3.4.4 關于特異性
    3.5 小結
第四章 P48蛋白核酸適配體的篩選
    4.1 材料
        4.1.1 儀器
        4.1.2 試劑
        4.1.3 溶液的配制
    4.2 方法
        4.2.1 CE-SELEX
        4.2.2 鎳樹脂SELEX
        4.2.3 微孔板SELEX
    4.3 結果
        4.3.1 CE-SELEX結果
        4.3.2 鎳樹脂法結果
        4.3.3 微孔板法篩選適配體
    4.4 討論
        4.4.1 關于篩選方法
        4.4.2 關于鑒定方法
        4.4.3 關于二級結構
    4.5 小結
第五章 應用適配體、單克隆抗體建立牛支原體抗體檢測方法
    5.1 材料
    5.2 方法
        5.2.1 單抗10E和適配體WKB-14比較
        5.2.2 直接競爭ELISA （Dc-ELISA）的建立
        5.2.3 間接競爭ELAA （Ic-ELAA）方法的建立
        5.2.4 檢測牛血清臨床樣本
    5.3 結果
        5.3.1 mAb 10E與WKB-14敏感性與特異性比較
        5.3.2 Dc-ELISA方法的建立
        5.3.3 Ic-ELAA方法的建立
        5.3.4 臨床牛血清檢測
    5.4 討論
        5.4.1 關于mAb 10E與適配體WKB-14比較
        5.4.2 關于特異性
        5.4.3 關于Ic-ELAA
        5.4.4 關于五種血清學方法比較
    5.5 小結
第六章 結論
第七章 創(chuàng)新點
參考文獻
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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[9]適配體篩選方法研究進展[J]. 王巍,賈凌云.  分析化學. 2009(03)
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博士論文
[1]體外篩選炭疽桿菌芽孢適配子的研究與初步應用[D]. 甄蓓.第一軍醫(yī)大學 2002



本文編號：2971671