坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）是導致肉鴨神經(jīng)癥狀及產(chǎn)蛋鴨出血性卵巢炎（duck hemorrhagic ovaritis，DHO）的主要病原，主要引起20日齡以內(nèi)的雛鴨出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)癥狀，死淘率增高及產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋大幅下降。發(fā)病雛鴨通常表現(xiàn)為采食量下降，腹瀉，共濟失調(diào)，癱瘓等癥狀。發(fā)病蛋鴨體溫升高；四肢無力、癱瘓；食欲廢絕；發(fā)病后不久開始產(chǎn)蛋大幅下降；發(fā)病后期排草綠色稀便，氣味惡臭，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。剖檢可見卵泡破裂出血，卵黃性腹膜炎，脾臟出血，胰腺出血壞死，肝臟腫大、出血。TMUV屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類的恩塔亞病毒群，是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒，通過節(jié)肢動物的叮咬進行傳播而導致宿主發(fā)病。病毒的基因組全長約為11kb，包含5’和3’的非編碼區(qū)，僅含有一個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中包膜蛋白（Envelop protein，E）蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的吸附，融合，注入，血凝性及宿主范圍和細胞嗜性有密切關系；NS5蛋白為TMUV分子量最大的蛋白，也是最保守的蛋白，它具有RNA依賴的... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
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中文摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 坦布蘇病毒病概述
    1.2 TMUV 的生物學特性
        1.2.1 TMUV 的分類地位
        1.2.2 黃病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2.3 黃病毒的基因組及編碼蛋白
        1.2.4 黃病毒的復制機制
        1.2.5 黃病毒基因組末端倒置互補序列
        1.2.6 TMUV 的研究進展
    1.3 RNAi 研究進展
        1.3.1 RNAi 概念
        1.3.2 RNAi 在抗病毒治療中的應用
        1.3.3 黃病毒 RNAi 研究進展
    1.4 腺病毒載體研究進展
    1.5 研究的目的意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株及抗體
        2.1.2 實驗動物及細胞
        2.1.3 主要試劑、試劑盒及化學藥品
        2.1.4 試劑的配制
        2.1.5 載體
        2.1.6 主要儀器設備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 TMUV 半套式 RT-PCR 檢測方法的建立與應用
        2.2.2 TMUV RT-LAMP 檢測方法的建立與應用
        2.2.3 TMUV 多種核酸檢測方法的比較
        2.2.4 不同宿主來源的 TMUV 的分離與鑒定
        2.2.5 TMUV 山東分離株 SD1001 全基因序列測定
        2.2.6 靶向干擾 TMUV E 基因和 NS5 基因的 shRNA 序列的篩選
        2.2.7 干擾 TMUV 復制的重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定及體外干擾試驗
3 結(jié)果
    3.1 TMUV 半套式 RT-PCR 檢測方法的建立與應用
        3.1.1 半套式 RT-PCR 檢測方法的特異性試驗結(jié)果
        3.1.2 半套式 RT-PCR 檢測方法的敏感性
        3.1.3 半套式 RT-PCR 對 TMUV 臨床樣品的檢測結(jié)果
    3.2 TMUV RT-LAMP 檢測方法的建立與應用
        3.2.1 TMUV RT-LAMP 檢測方法的敏感性試驗結(jié)果
        3.2.2 TMUV RT-LAMP 檢測方法的特異性試驗結(jié)果
        3.2.3 臨床樣品檢測結(jié)果
    3.3 TMUV 多種核酸檢測方法的比較
        3.3.1 多種檢測方法的敏感性試驗結(jié)果
        3.3.2 多種檢測方法的特異性試驗結(jié)果
        3.3.3 臨床樣品檢測結(jié)果
    3.4 不同宿主來源的 TMUV 的分離與鑒定
        3.4.1 不同宿主來源的 TMUV 流行病學調(diào)查
        3.4.2 麻雀分離株 TMUV-SDHS 鴨胚培養(yǎng)特性
        3.4.3 麻雀分離株 TMUV-SDHS 細胞培養(yǎng)特性
        3.4.4 蚊源分離株 TMUV-SDHS 細胞培養(yǎng)特性
        3.4.5 TMUV-SDHS 的 E 基因和 NS5 基因的遺傳進化分析結(jié)果
        3.4.6 TMUV-SDHS 及 TMUV-SDMS 株對產(chǎn)蛋鴨致病性研究結(jié)果
    3.5 TMUV 山東分離株 SD1001 全基因序列測定
        3.5.1 TMUV 基因組分析結(jié)果
        3.5.2 TMUV 病毒的蛋白的氨基酸比對結(jié)果
        3.5.3 TMUV 5’末端和 3’末端非編碼區(qū)的分析
        3.5.4 TMUV 病毒的蛋白的潛在糖基化位點預測
        3.5.5 TMUV 開放閱讀框 Bootscan 掃描
    3.6 靶向干擾 TMUV E 基因和 NS5 基因的 shRNA 序列的篩選
        3.6.1 重組載體 pEGFP-E 及 pEGFP-NS5 載體的測序鑒定
        3.6.2 轉(zhuǎn)染用細胞的選擇
        3.6.3 熒光標簽載體轉(zhuǎn)染 293T 細胞
        3.6.4 shRNA 干擾 E-GFP 和 NS5-GFP 融合蛋白的表達
        3.6.5 shRNA 干擾載體與 GFP 融合蛋白的表達載體共轉(zhuǎn)染后的流式細胞檢測
        3.6.7 E 基因和 NS5 基因的相對熒光定量檢測結(jié)果
    3.7 干擾 TMUV 復制的重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定及體外干擾試驗
        3.7.1 重組腺病毒的包裝出毒
        3.7.2 重組腺病毒的鑒定
        3.7.3 重組腺病毒滴度的測定
        3.7.4 重組腺病毒介導的 shRNA 體外干擾 TMUV 復制的研究
4 討論
    4.1 TMUV 核酸檢測方法的建立及多種核酸檢測方法的比較
        4.1.1 TMUV 半套式 RT-PCR 檢測方法的建立與應用
        4.1.2 TMUV RT-LAMP 檢測方法的建立與應用
        4.1.3 TMUV 多種核酸檢測方法的比較
    4.2 不同宿主來源的 TMUV 的分離與鑒定
    4.3 TMUV 山東分離株 SD1001 全基因序列測定
    4.4 重組腺病毒介導的 shRNA 干擾 TMUV 復制的研究
5 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
博士在讀期間發(fā)表論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]鴨出血性卵巢炎的初步研究[J]. 曹貞貞,張存,黃瑜,刁有祥,葉偉成,劉月煥,韓婧文,馬國明,張冬冬,許豐,王丹,姜甜甜,袁媛,謝小雨,高緒慧,唐熠,施少華,萬春和,張晨,何玢,楊夢婕,陸新浩,張冰,張國中,馬學軍,張大丙.  中國獸醫(yī)雜志. 2010(12)
[2]以AdMax載體系統(tǒng)構(gòu)建和制備腎癌相關抗原G250基因重組腺病毒表達載體[J]. 齊桓.  南方醫(yī)科大學學報. 2008(09)



本文編號：2971508